உலகளாவிய உணவுப் பற்றாக்குறையைச் சமாளிப்பதிலும், பூச்சிகளால் பரவும் மனித நோய்களை எதிர்த்துப் போராடுவதிலும் பூச்சிக்கொல்லிகள் ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிக்கின்றன. இருப்பினும், பூச்சிக்கொல்லி எதிர்ப்பின் வளர்ந்து வரும் பிரச்சனை, குறைவாகப் பயன்படுத்தப்படும் இலக்குகளைக் குறிவைக்கும் புதிய சேர்மங்களைக் கண்டுபிடிப்பதை அவசரமாக அவசியமாக்குகிறது. பூச்சிகளின் தற்காலிக ஏற்பி ஆற்றல் (TRPV) கால்வாய்களான நான்சோங் (Nan) மற்றும் செயலற்ற (Iav) ஆகியவை, வேற்று இனக் கால்வாய்களை (Nan-Iav) உருவாக்கி, பூச்சிகளில் புவி ஈர்ப்பு நாட்டம், கேட்டல் மற்றும் உடலமைவு உணர்வு ஆகியவற்றை மத்தியஸ்தம் செய்யும் இயக்க உணர் உறுப்புகளில் நிலைபெற முடியும். அஃபிடோபைரோலிடோன் (AP) போன்ற சில பூச்சிக்கொல்லிகள், அறியப்படாத வழிமுறைகள் மூலம் Nan-Iav-ஐ குறிவைக்கின்றன. AP, துளைத்து உறிஞ்சும் பூச்சிகளுக்கு (ஹெமிப்டெரன்கள்) எதிராகச் செயல்படுகிறது; இது இழைகளின் செயல்பாட்டைச் சீர்குலைப்பதன் மூலம் அவை உணவூட்டுவதைத் தடுக்கிறது. AP, Nan உடன் மட்டுமே பிணைக்க முடியும், ஆனால் Nan-Iav மட்டுமே அகச்சார்ந்த நிக்கோடினமைடு (NAM) உள்ளிட்ட தூண்டிகளுடன் தொடர்பு கொண்டு, அதன் மூலம் கால்வாய் செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்த முடியும். பூச்சிக்கொல்லி இலக்காக நான்-ஐஏவி-க்கு உள்ள சாத்தியக்கூறுகள் இருந்தபோதிலும், அதன் கால்வாய் உருவாக்கம், ஒழுங்குபடுத்தும் பிணைப்புத் தளங்கள் மற்றும் Ca2+-சார்ந்த ஒழுங்குமுறை பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை, இது மேலும் பூச்சிக்கொல்லி மேம்பாட்டைத் தடுக்கிறது. இந்த ஆய்வில், ஹெமிப்டெரா பூச்சிகளில் கால்மோடூலின்-இணைப்பி இல்லாத நிலையிலும், அன்கைரின் ரிப்பீட் சைட்டோபிளாஸ்மிக் டொமைனின் (ARD) எல்லையில் AP மற்றும் NAM இருக்கும்போதும் நான்-ஐஏவி-யின் கட்டமைப்பைத் தீர்மானிக்க கிரையோ-எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி பயன்படுத்தப்பட்டது. ஆச்சரியப்படும் விதமாக, நான் புரதமே ஒரு பென்டாமரை உருவாக்க முடியும் என்பதையும், அது AP-மத்தியஸ்த ARD இடைவினைகளால் நிலைப்படுத்தப்படுகிறது என்பதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். இந்த ஆய்வு, பூச்சிக்கொல்லிகள் மற்றும் அகோனிஸ்டுகளுக்கும் நான்-ஐஏவி-க்கும் இடையிலான மூலக்கூறு இடைவினைகளை வெளிப்படுத்துகிறது, கால்வாய் செயல்பாடு மற்றும் உருவாக்கத்தில் ARD-யின் முக்கியத்துவத்தை எடுத்துக்காட்டுகிறது, மேலும் Ca2+ ஒழுங்குமுறையின் வழிமுறையை ஆராய்கிறது.
மேலும் தீவிரமடைந்து வரும் உலகளாவிய காலநிலை மாற்றத்தின் பின்னணியில், மோசமடைந்து வரும் உலகளாவிய உணவுப் பாதுகாப்பு, சமூகத்தில் தொடர் விளைவுகளை ஏற்படுத்தும் 21 ஆம் நூற்றாண்டின் முக்கிய சவால்களில் ஒன்றாகத் திகழ்கிறது.1,2உலக சுகாதார அமைப்பின் 'உலகில் உணவுப் பாதுகாப்பு மற்றும் ஊட்டச்சத்தின் நிலை 2023' (SOFI) அறிக்கையின்படி, உலகளவில் சுமார் 233 கோடி மக்கள், நீண்டகாலப் பிரச்சனையான மிதமான முதல் கடுமையான உணவுப் பாதுகாப்பின்மையால் பாதிக்கப்பட்டுள்ளனர் என்று மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது.3,4துரதிர்ஷ்டவசமாக, ஆண்டுதோறும் மதிப்பிடப்பட்ட 20% முதல் 30% அல்லது அதற்கும் மேற்பட்ட பயிர் விளைச்சல் பூச்சிகள் மற்றும் நோய்க்கிருமிகளால் இழக்கப்படுகிறது, மேலும் புவி வெப்பமயமாதல் பூச்சிகளின் எதிர்ப்புத்திறனையும் பயிர்களின் பாதிப்புத்தன்மையையும் அதிகரிக்கக்கூடும் என எதிர்பார்க்கப்படுகிறது.4,5,6,7,8பயிர்களைப் பூச்சிகளிடமிருந்து பாதுகாப்பதற்கும், நோய்க்கடத்திகளால் பரவும் நோய்க்கிருமிகளின் பரவலைக் குறைப்பதற்கும் மட்டுமல்லாமல், பூச்சிக்கொல்லிகளுக்கு அதிகளவில் எதிர்ப்புத்திறன் பெற்றுவரும் டெங்கு காய்ச்சல், மலேரியா மற்றும் சாகாஸ் நோய் போன்ற நோய்க்கடத்திகளால் பரவும் மனித நோய்களை எதிர்த்துப் போராடுவதற்கும் பூச்சிக்கொல்லி உருவாக்கம் மிகவும் இன்றியமையாதது.5,9,10,11
நரம்பு மண்டலத்தைப் பாதிக்கும் பூச்சிக்கொல்லிகளின் முக்கிய இலக்குகளில், ஹெட்டரோடெட்ராமெரிக் TRPV சேனலான நான்சுங் (நான்)-இனாக்டிவ் (Iav) என்பது, இமிடாக்ளோப்ரிட் மற்றும் பைராக்ளோஸ்ட்ரோபின் போன்ற வணிகரீதியாகக் கிடைக்கும் பூச்சிக்கொல்லிகள் உட்பட, கடந்த பத்தாண்டுகளில் மட்டுமே கண்டறியப்பட்ட ஒரு வகை பூச்சிக்கொல்லி இலக்குகளைக் குறிக்கிறது.12,13,14அஃபிடோபைரோலிஃபென் (AP) எனும் பகுதி செயற்கை பூச்சிக்கொல்லி, சமீபத்தில் உருவாக்கப்பட்டு வணிகமயமாக்கப்பட்ட ஒரு தயாரிப்பாகும். இதன் முக்கிய அங்கமாக இன்ஸ்காலிஸ்® எனும் செயல்திறன் மிக்க பூச்சிக்கொல்லி உள்ளது, இது AP உடன் சப்நானோமோலார் செயல்பாட்டு மட்டத்தில் பிணைக்கிறது.15AP ஆனது மகரந்தச் சேர்க்கையாளர்கள், நன்மை பயக்கும் பூச்சிகள் மற்றும் பிற இலக்கற்ற உயிரினங்களுக்குக் குறைந்த அளவிலான உடனடி நச்சுத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளது. மேலும், லேபிளில் உள்ள அறிவுறுத்தல்களின்படி பயன்படுத்தும்போது, இது மற்ற பூச்சிக்கொல்லிகளுக்கு எதிரான எதிர்ப்பு அழுத்தத்தைக் குறைக்க வல்லது.16,17,18Nan மற்றும் Iav ஆகியவை பூச்சி இனங்கள் முழுவதும் பரவலாகக் காணப்படுகின்றன; இவை உணர்கொம்புகள் மற்றும் கை கால்களில் உள்ள தசைநார் நீட்சி ஏற்பி நரம்பணுக்களில் மட்டுமே இணைந்து வெளிப்படுகின்றன, மேலும் கேட்டல், புவியீர்ப்பு உணர்தல் மற்றும் உடலமைவு உணர்தல் ஆகியவற்றுக்கு இன்றியமையாதவையாகும்.13,16,19,20,21,22AP, இமிடாக்ளோப்ரிட் மற்றும் பைராக்ளோஸ்ட்ரோபின் ஆகியவை ஒரு தனித்துவமான வழிமுறையின் மூலம் நான்-ஐஏவி கூட்டமைப்பைத் தூண்டி, இறுதியில் உடலசைவு உணர்வு சமிக்ஞை கடத்தலைத் தடுக்கின்றன.13,16,23அசுவினி மற்றும் வெள்ளை ஈக்கள் போன்ற துளைத்து உறிஞ்சும் பூச்சிகளில் (ஹெமிப்டெரன்கள்), உடலின் நிலை குறித்த உணர்வு இழப்பு அவற்றின் உணவூட்டும் திறனைக் குறைத்து, இறுதியில் இறப்புக்கு வழிவகுக்கிறது.13,24சுவாரஸ்யமாக, AP ஆனது Nan-Iav கூட்டுப்பொருளுடன் அதிக ஈர்ப்பையும், தனியாக Nan உடன் குறைந்த ஈர்ப்பையும் வெளிப்படுத்துகிறது. AP ஆனது Nan-Iav உடன் பிணைவது ஒரு மின்சாரத்தைத் தூண்டுகிறது, ஆனால் தனியாக Nan உடன் பிணைவது கால்வாய் செயல்பாட்டைத் தூண்டுவதில்லை. Iav ஆனது AP உடன் சிறிதும் பிணைவதில்லை.16இது, Nan மற்றும் Iav ஆகியவை பிணைந்து வெவ்வேறு Nan-Iav கால்வாய்க் கூட்டுக்களை (எ.கா., வெவ்வேறு விகிதாச்சாரங்களில் அல்லது ஒரே விகிதாச்சாரத்திற்குள் வெவ்வேறு அமைப்புகளில்) உருவாக்கக்கூடும் என்பதையோ அல்லது AP பல தளங்களில் பிணைக்கக்கூடும் என்பதையோ சுட்டிக்காட்டுகிறது. மேலும், இயற்கையான தூண்டியான நிக்கோடினமைடு (NAM), ட்ரோசோஃபிலா Nan-Iav உடன் மைக்ரோமோலார் ஈர்ப்புத்திறனுடன் பிணைந்து, ஆய்வகச் சூழலில் அசுவினிகளின் (AP) விளைவுகளைப் போன்ற விளைவுகளை வெளிப்படுத்துகிறது.16,25மேலும் அசுவினி பூச்சிகளின் இனப்பெருக்கத்தையும் உணவூட்டத்தையும் தடுப்பதன் மூலம், இறுதியில் அவற்றின் இறப்புக்கு வழிவகுக்கிறது.25,26இந்தத் தரவுகள் பல கேள்விகளை எழுப்புகின்றன. உதாரணமாக, Nan-Iav ஹெட்டிரோடைமர் எவ்வாறு உருவாகிறது, சிறிய மூலக்கூறுகளை நெறிப்படுத்த எந்தப் பிணைப்புத் தளங்கள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, மற்றும் இந்தச் சிறிய மூலக்கூறுகள் உடலசைவு உணர்வை அடக்குவதன் மூலம் கால்வாய் செயல்பாட்டை எவ்வாறு ஒழுங்குபடுத்துகின்றன என்பன போன்றன இன்னும் தெளிவாகத் தெரியவில்லை. மேலும், Nan தானே செயலற்றதாகவும் AP-உடன் குறைந்த ஈர்ப்பைக் கொண்டதாகவும் இருக்கும்போது, Nan-Iav ஹெட்டிரோடைமர் செயலில் இருந்து AP-உடன் அதிக ஈர்ப்பைக் கொண்டு பிணைவதற்கான காரணங்களும் தெளிவாக இல்லை. இறுதியாக, Nan-Iav செயல்பாட்டின் Ca2+-சார்ந்த ஒழுங்குமுறை மற்றும் அது நரம்பியல் சமிக்ஞை செயல்முறைகளில் எவ்வாறு ஒருங்கிணைக்கப்படுகிறது என்பது பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை.13,21
இந்த ஆய்வில், கிரையோ-எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி, எலக்ட்ரோபிசியாலஜி மற்றும் ரேடியோலிகண்ட் பிணைப்பு நுட்பங்களை ஒருங்கிணைத்து, நான்-ஐஏவி-யின் உருவாக்கத்தையும், சிறிய மூலக்கூறு ஒழுங்குபடுத்திகளுடன் அது பிணைக்கும் வழிமுறையையும் நாங்கள் தெளிவுபடுத்தினோம். மேலும், ஐஏவி மற்றும் ஏபி-யால் நிலைப்படுத்தப்பட்ட நான் பென்டாமர்களுடன் தொடர்ச்சியாகப் பிணைக்கப்பட்ட கால்மோடூலினை (CaM) நாங்கள் கண்டறிந்தோம். இந்த முடிவுகள், கால்வாய்களில் கால்சியம் அயனிகளின் ஒழுங்குமுறை, கால்வாய் உருவாக்கம் மற்றும் லிகண்ட் பிணைப்பு நாட்டத்தைத் தீர்மானிக்கும் காரணிகள் குறித்த முக்கியமான நுண்ணறிவுகளை வழங்குகின்றன. மிக முக்கியமாக, இந்த செயல்முறைகளில் ஏஆர்டி ஒரு மையப் பங்கை வகிக்கிறது என்பதை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம். தொடர்புடைய விவசாய பூச்சிக்கொல்லிகளுடன் பிணைக்கப்பட்ட முழுமையான பூச்சிக் கால்வாய்கள் குறித்த எங்கள் ஆய்வு...27, 28, 29பூச்சிக்கொல்லித் தொழிற்துறையின் வளர்ச்சிக்கு வாய்ப்புகளைத் திறந்துவிடுவதோடு, பூச்சிக்கொல்லிகளின் செயல்திறனையும் தனித்தன்மையையும் மேம்படுத்துவதோடு, உலகளாவிய உணவுப் பாதுகாப்பைக் கையாள்வதற்கும் நோய்க்கடத்திகளால் பரவும் நோய்களைத் தடுப்பதற்கும், TRPV-ஐ இலக்காகக் கொண்ட சேர்மங்களை மற்ற உயிரினங்களுக்குப் பயன்படுத்துவதையும் இது சாத்தியமாக்குகிறது.
Nan-Iav ஆனது Ca2+ ஆல் ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது என்பதையும், அந்த ஒழுங்குபடுத்தும் பொறிமுறையானது இயல்பாகவே பிணைக்கப்பட்ட CaM ஆல் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுகிறது என்பதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். முக்கியமாக, CaM ஆல் Nav இன் இந்த Ca2+ சார்ந்த ஒழுங்குபடுத்தலானது, மற்ற அயன் சேனல்களின் (எ.கா., மின்னழுத்த-கட்டுப்படுத்தப்பட்ட Na+ சேனல்கள் மற்றும் TRPV5/6 சேனல்கள்) ஒழுங்குபடுத்தும் பொறிமுறைகளிலிருந்து கணிசமாக வேறுபடுகிறது.52,53,54,55,56,57Nav1.2 சேனலில், CaM-இன் C-முனைப் பகுதியானது C-முனைப் பகுதியுடன் (CTD) சுருள் வடிவில் இணைகிறது, மேலும் Ca2+ அயனியானது அதன் N-முனைப் பகுதியை CTD-இன் தொலைவுப் பகுதியுடன் பிணைக்கத் தூண்டுகிறது.56TRPV5/6 கால்வாயில், CaM-இன் C-முனைப் பகுதி CTH உடன் பிணைகிறது, மேலும் Ca2+ அயனியானது அதன் N-முனைப் பகுதியைத் துளைக்குள் மேல்நோக்கி நீட்டிக்கத் தூண்டுகிறது, இதன் மூலம் நேர்மின் அயனி ஊடுருவலைத் தடுக்கிறது.53,54Nan-Iav-CaM-இன் Ca2+-ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட செயல்பாட்டிற்கான ஒரு மாதிரியை நாங்கள் முன்மொழிகிறோம் (படம் 4h). இந்த மாதிரியில், CaM-இன் N-முனைப் பகுதி, Iav-இன் C-முனைப் பகுதியுடன் (CTH) தொடர்ந்து பிணைந்துள்ளது. ஓய்வு நிலையில் (குறைந்த [Ca2+] செறிவு), CaM-இன் C-முனைப் பகுதி Nan-உடன் இடைவினை புரிந்து, ARD-இன் வடிவத்தை நிலைப்படுத்தி, அதன் மூலம் கால்வாய் திறப்பை ஊக்குவிக்கிறது. ஒரு தூண்டி/பூச்சிக்கொல்லி கால்வாயுடன் பிணைவது, துளை திறப்பைத் தூண்டி, Ca2+ உள்ளீட்டிற்கு வழிவகுக்கிறது. பின்னர் Ca2+, CaM-உடன் பிணைந்து, Nan-இன் ARD-இலிருந்து C-முனைப் பகுதியைப் பிரிக்கிறது. CaM பிணைப்பைத் தடுப்பது, Ca2+-இன் தடுப்பு விளைவை முற்றிலுமாக நீக்கிவிடுவதால், இந்தப் பிரிதல் ARD-இன் இயக்கத்தை மாற்றியமைத்து, அதன் மூலம் Ca2+-சார்ந்த தடுப்பு அல்லது உணர்வுக் குறைவை ஏற்படுத்துகிறது. கால்சியம் அயனி வெளியேற்றத்திற்குப் பிறகு சேனல் மின்னோட்டங்கள் விரைவாக மீள்வது (படம் 4g), இந்த வழிமுறை Ca2+-மத்தியஸ்த நரம்பியல் சமிக்ஞைகளுக்கு விரைவான பதில்களை எளிதாக்குகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது. மேலும், இன்னும் முழுமையாகப் புரிந்து கொள்ளப்படாத Iav-இன் C-முனைப் பகுதி, சேனல் இலக்காக்கம் மற்றும் மின்னோட்ட ஒழுங்குமுறையில் பிற பாத்திரங்களை வகிப்பதாகக் கூறப்படுகிறது.21
இறுதியாக, எங்கள் ஆய்வு, விவசாய முக்கியத்துவம் வாய்ந்த ஒரு பூச்சிக்கொல்லி-பூச்சிக்கொல்லி TRP வழித்தடக் கூட்டமைப்பின் உயர்-தெளிவுத்திறன் கட்டமைப்பை முன்வைக்கிறது—இதுவரை எங்களுக்குத் தெரியாத ஒரு கண்டுபிடிப்பு. குறிப்பாக, நாங்கள் பூச்சி செல்களுக்குப் பதிலாக மனித செல்களில் (HEK293S GnTi–) இந்தப் பூச்சி வழித்தடத்தின் கட்டமைப்பையும் செயல்பாட்டையும் விவரித்துள்ளோம். அதிகரித்து வரும் பூச்சிக்கொல்லி எதிர்ப்புத்திறன் மற்றும் உணவுப் பாதுகாப்பு, நோய்க்கிருமிகள் மீதான தொடர்ச்சியான அழுத்தம் ஆகியவற்றின் பின்னணியில், மனித ஆரோக்கியம் மற்றும் உலகளாவிய உணவுப் பாதுகாப்பின் நன்மைக்காக புதிய பூச்சிக்கொல்லிகளின் உருவாக்கத்தை எளிதாக்கும் முக்கியமான தகவல்களை எங்கள் பணி வழங்குகிறது. AP போன்ற பூச்சிக்கொல்லிகள், லேபிளில் உள்ள அறிவுறுத்தல்களின்படி பயன்படுத்தப்படும்போது சில பூச்சிகளுக்கு எதிராகப் பயனுள்ளதாகவும், நன்மை பயக்கும் மகரந்தச் சேர்க்கையாளர்களுக்குக் குறைந்த தீவிர நச்சுத்தன்மையைக் கொண்டதாகவும் உள்ளன என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன, இது அவற்றின் சுற்றுச்சூழல் பாதுகாப்பை நிரூபிக்கிறது.13,16மேலும், கொசுக்களில் சில AP வழிப்பொருட்களைச் சோதித்ததில், அவை இறுதியில் பறக்கும் திறனை இழக்கின்றன என்பது தெரியவந்துள்ளது. இந்த சீராக்கும் சேர்மங்கள் நான்-ஐஏவி உடன் எவ்வாறு பிணைகின்றன என்பதைப் புரிந்துகொள்வது, தற்போதுள்ள சேர்மங்களை மாற்றியமைப்பதற்கோ அல்லது மிகவும் பயனுள்ள புதிய சேர்மங்களை உருவாக்குவதற்கோ வழிவகுக்கும்.துல்லியமானபூச்சிக் கட்டுப்பாடு. உள்ளார்ந்த சேர்மங்கள், பூச்சிக்கொல்லிகள் மற்றும் Ca2+-CaM ஆகியவற்றின் செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துவதற்கு மட்டுமல்லாமல், சேனல் உருவாக்கத்திற்கும் Nan-Iav ARD இடைமுகம் இன்றியமையாதது என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது. சிறிய மூலக்கூறுகளைக் கொண்டு ஹெட்டிரோடைமர் உருவாக்கத்தைச் சீர்குலைப்பது, அயன் சேனல் தடுப்பான்களை உருவாக்குவதற்கான ஒரு தனித்துவமான மற்றும் நம்பிக்கைக்குரிய அணுகுமுறையாக இருக்கலாம் என்று நாங்கள் பரிந்துரைக்கிறோம்.
எட்டு ஆர்த்தோலாகஸ் மரபணுக்களில், சலவைக்கலவைகளில் சிறந்த நிலைத்தன்மையைக் காட்டும் பழுப்பு வண்டின் (Halyomorpha halys) முழு நீள மரபணுக்களான நான்சுங் மற்றும் இன்ஆக்டிவ் ஆகியவை தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. தொகுக்கப்பட்ட மரபணுக்கள் மனித வெளிப்பாட்டிற்காக கோடான்-உகந்ததாக்கப்பட்டு, XhoI மற்றும் EcoRI கட்டுப்படுத்தல் தளங்களைப் பயன்படுத்தி pBacMam pCMV-DEST வெக்டரில் (லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) குளோன் செய்யப்பட்டன. இது, HRC-3C புரோட்டியேஸ் (PPX) மூலம் பிளவுபடுத்தப்படும் C-முனைய GFP-FLAG-10xHis மற்றும் mCherry-FLAG-10xHis குறிப்பான்களுடன் குளோன்கள் ஒரே வரிசையில் இருப்பதை உறுதிசெய்தது, இது சுயாதீனமான செயல்பாட்டை அனுமதித்தது.வெளிப்பாடுநான்சுங் மற்றும் இன்ஆக்டிவ் ஆகியவற்றை pBacMam வெக்டரில் குளோன் செய்யப் பயன்படுத்தப்பட்ட பிரைமர்கள் பின்வருமாறு:
K3 கேமரா மற்றும் Gatan BioQuantum ஆற்றல் வடிகட்டி பொருத்தப்பட்ட Titan Krios G2 டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோப் (FEI) மூலம் தனிப்பட்ட துகள்களின் நுண்ணிய படங்கள் பெறப்பட்டன. இந்த மைக்ரோஸ்கோப் 300 keV-ல், 20 eV ஆற்றல் அமைப்பு, 1.08 Å/பிக்சல் மாதிரி பிக்சல் அளவு (81,000x பெயரளவு உருப்பெருக்கம்), மற்றும் -0.8 முதல் -2.2 μm வரையிலான டீஃபோகஸ் கிரேடியன்ட் ஆகியவற்றுடன் இயக்கப்பட்டது. Gatan நிறுவனத்தின் Latitude S மைக்ரோஸ்கோப்பைப் பயன்படுத்தி, வினாடிக்கு 40 பிரேம்கள் என்ற வேகத்தில் வீடியோ பதிவு செய்யப்பட்டது. இதன் பெயரளவு டோஸ் வீதம் 25 e–px−1 s−1, வெளிப்பாட்டு நேரம் 2.4 வி, மற்றும் மொத்த டோஸ் தோராயமாக 60 e–Å−2 ஆகும்.
RELION 4.061-இல் உள்ள MotionCor2-ஐப் பயன்படுத்தி, படச்சுருளில் கற்றை-தூண்டப்பட்ட இயக்கத் திருத்தம் மற்றும் டோஸ் எடையிடல் ஆகியவை செய்யப்பட்டன. கிரையோஸ்பார்க்கில், பேட்ச்-அடிப்படையிலான CTF மதிப்பீட்டு முறை62-ஐப் பயன்படுத்தி, கான்ட்ராஸ்ட் டிரான்ஸ்ஃபர் ஃபங்ஷன் (CTF) அளவுரு மதிப்பீடு செய்யப்பட்டது. CTF பொருத்தும் தெளிவுத்திறன் ≥4 Å கொண்ட ஒளிநுண்படங்கள் அடுத்தடுத்த பகுப்பாய்விலிருந்து விலக்கப்பட்டன. வழக்கமாக, கிரையோஸ்பார்க்கில் புள்ளித் தேர்வுக்காக 500–1000 ஒளிநுண்படங்களின் ஒரு துணைத்தொகுப்பு பயன்படுத்தப்பட்டது. அதனைத் தொடர்ந்து, வார்ப்புரு-அடிப்படையிலான துகள் தேர்வுக்கான தெளிவான குறிப்புப் படத்தைப் பெறுவதற்காக, வடிகட்டிய பிறகு பல சுற்று 2D வகைப்பாடு செய்யப்பட்டது. பின்னர், 64-பிக்சல் எல்லைப் பெட்டிகள் மற்றும் 4-மடங்கு பின்னிங் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி துகள்கள் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. தேவையற்ற துகள் வகைகளை நீக்குவதற்காக பல சுற்று 2D வகைப்பாடு செய்யப்பட்டது. கிரையோஸ்பார்க்கில், ஆப் இனிஷியோ புனரமைப்பு மூலம் ஆரம்ப 3D மாதிரி புனரமைக்கப்பட்டு, சீரற்ற சுத்திகரிப்பு மூலம் செம்மைப்படுத்தப்பட்டது. ARD பன்முகத்தன்மையின் அடிப்படையில் கிரையோஸ்பார்க் அல்லது RELION-இல் 3D வகைப்பாடு செய்யப்பட்டது. சவ்வுப் பகுதிகளின் குறிப்பிடத்தக்க பன்முகத்தன்மை எதுவும் காணப்படவில்லை. C1 மற்றும் C2 முறைகளைப் பயன்படுத்தித் துகள்கள் சுத்திகரிக்கப்பட்டன; அதிக C2 பிரிதிறன் கொண்ட துகள்கள், C2-ஐப் பொறுத்து சமச்சீரானவையாகக் கருதப்பட்டு, பேயீசியன் சுத்திகரிப்பிற்காக RELION-க்குள் இறக்குமதி செய்யப்பட்டன. பின்னர், இறுதி சீரற்ற மற்றும் உள்ளூர் சுத்திகரிப்பிற்காக அத்துகள்கள் மீண்டும் cryoSPARC-க்கு மாற்றப்பட்டன. இறுதிப் பிரிதிறன் மற்றும் துகள் எண்ணிக்கைகள் அட்டவணை 1-இல் காட்டப்பட்டுள்ளன.
Nan+AP பென்டாமர்களைச் செயலாக்கும்போது, சிக்னல் கழித்தல் மற்றும் TMD மாஸ்கிங் போன்ற சவ்வு டொமைன்களின் (குறிப்பாக துளைப் பகுதி) பிரிதிறனை மேம்படுத்துவதற்கான பல்வேறு முறைகளை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். இருப்பினும், துளைப் பகுதியில் ஏற்படக்கூடிய அதீத ஒழுங்கின்மை மற்றும் TMD-யின் ஒட்டுமொத்த பன்முகத்தன்மை காரணமாக இந்த முயற்சிகள் தோல்வியடைந்தன. கிரையோஸ்பார்க்கில் உள்ள சீரற்ற செயலாக்க முறையால் தானாக உருவாக்கப்பட்ட ஒரு மாஸ்க்கைப் பயன்படுத்தி இறுதிப் பிரிதிறன் கணக்கிடப்பட்டது; இது முதன்மையாக ARD பகுதியை இலக்காகக் கொண்டது. இது சவ்வு டொமைன்களின் (குறிப்பாக VSLD பகுதி) பிரிதிறனை விட கணிசமாக அதிக பிரிதிறனை அடைந்தது.
நான்சுங் மற்றும் இன்ஆக்டிவ் பூச்சிகளின் அப்போ வடிவங்களின் ஆரம்பகால டி நோவோ மாதிரிகள் முதலில் கூட்63 (Coot63) ஐப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டன, மேலும் குறைந்த நம்பகத்தன்மை கொண்ட பகுதிகளை அடையாளம் காண நான் மற்றும் ஐயாவ் பூச்சிகளின் மாதிரிகள் ஆல்பாஃபோல்ட்264 (AlphaFold264) ஐப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டன. கால்மோடூலின் மாதிரியாக்கம், முறையே PDB அணுகல் எண்கள் 4JPZ56 மற்றும் 1CFD65 இல் உள்ள Ca2+-பிணைப்பு மற்றும் Ca2+-இல்லாத மாதிரிகளின் திட-உடல் பொருத்தங்களை அடிப்படையாகக் கொண்டது. சரியான ஸ்டீரியோவேதியியல் மற்றும் நல்ல வடிவவியலை உறுதி செய்வதற்காக, கோளச் செம்மைப்படுத்தலைப் பயன்படுத்தி மாதிரிகள் செம்மைப்படுத்தப்பட்டன. பின்னர், பாஸ்பாடிடைல்கோலின், பாஸ்பாடிடைலெத்தனோலமைன் மற்றும் பாஸ்பாடிடைல்செரின் ஆகியவை நன்கு வரையறுக்கப்பட்ட லிப்பிட் அடர்த்திகளாக மாதிரியாக்கப்பட்டன, மேலும் NAM மற்றும் AP லிகண்டுகள் இறுக்கமான சந்திப்புகளில் அதற்கேற்ற அடர்த்திகளில் வைக்கப்பட்டன. ஐசோஃபார்ம்களின் SMILES சரத்திலிருந்து PHENIX66 இல் உள்ள eLBOW ஐப் பயன்படுத்தி கட்டுப்பாட்டுக் கோப்புகள் உருவாக்கப்பட்டன. இறுதியாக, உள்ளூர் கட்டத் தேடல் மற்றும் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு கட்டுப்பாடுகளுடன் கூடிய உலகளாவிய சிறுமமாக்கல் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, PHENIX-இல் மாதிரிகள் உண்மையான வெளியில் செம்மைப்படுத்தப்பட்டன. மாதிரி செம்மைப்படுத்தல் மற்றும் கட்டமைப்புப் பகுப்பாய்விற்காக MolProbity சேவையகம் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் PyMOL மற்றும் UCSF Chimera X ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி விளக்கப்படங்கள் உருவாக்கப்பட்டன. 67,68,69 துளைப் பகுப்பாய்வு HOLE சேவையகத்தைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது,70 மற்றும் தொடர் பாதுகாப்பு வரைபடமாக்கல் Consurf சேவையகத்தைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது.71
புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வானது இகோர் புரோ 6.2, எக்செல் ஆபிஸ் 365 மற்றும் கிராஃப்பேட் பிரிசம் 7.0 ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது. அனைத்து அளவுசார் தரவுகளும் சராசரி ± திட்டப் பிழை (SEM) என வழங்கப்பட்டுள்ளன. இரண்டு குழுக்களை ஒப்பிடுவதற்கு மாணவர் t-சோதனை (இருமுனை, இணைக்கப்படாதது) பயன்படுத்தப்பட்டது. பல குழுக்களை ஒப்பிடுவதற்கு ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு (ANOVA) மற்றும் அதைத் தொடர்ந்து டன்னெட்டின் பிந்தைய சோதனை பயன்படுத்தப்பட்டது. *P< 0.05, **P< 0.01, மற்றும் ***Pதரவுப் பரவலைப் பொறுத்து, < 0.001 மதிப்புகள் புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்கவையாகக் கருதப்பட்டன. Kd, Ki மதிப்புகள் மற்றும் அவற்றின் சமச்சீரற்ற 95% நம்பிக்கை இடைவெளிகள் GraphPad Prism 10-ஐப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன.
ஆய்வு முறையியல் குறித்த கூடுதல் விவரங்களுக்கு, இந்தக் கட்டுரையில் இணைக்கப்பட்டுள்ள நேச்சர் போர்ட்ஃபோலியோ அறிக்கை சுருக்கத்தைப் பார்க்கவும்.
PDB 4JPZ மற்றும் 1CFD தரவுத்தளங்களில் உள்ள கால்மோடூலின் மாதிரிகளைப் பயன்படுத்தி ஆரம்ப மாதிரி உருவாக்கப்பட்டது. அதன் ஆயத்தொலைவுகள், 9NVN (இணைப்பி இல்லாத நான்-ஐஏவி-CaM), 9NVO (நிகோடினமைடுடன் பிணைக்கப்பட்ட நான்-ஐஏவி-CaM), 9NVP (நிகோடினமைடு மற்றும் EDTA உடன் பிணைக்கப்பட்ட நான்-ஐஏவி-CaM), 9NVQ (அஃபினிடால்பைரோலின் மற்றும் கால்சியத்துடன் பிணைக்கப்பட்ட நான்-ஐஏவி-CaM), 9NVR (அஃபினிடால்பைரோலின் மற்றும் EDTA உடன் பிணைக்கப்பட்ட நான்-ஐஏவி-CaM), மற்றும் 9NVS (அஃபினிடால்பைரோலினுடன் பிணைக்கப்பட்ட நான் பென்டாமர்) ஆகிய அணுகல் எண்களின் கீழ் புரதத் தரவு வங்கியில் (PDB) சமர்ப்பிக்கப்பட்டுள்ளன. தொடர்புடைய கிரையோ-எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கிப் படங்கள், எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கித் தரவுத்தளத்தில் (EMDB) பின்வரும் அணுகல் எண்களின் கீழ் பதியப்பட்டுள்ளன: EMD-49844 (இணைப்பி இல்லாத Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (நிகோடினமைடுடன் கூடிய Nan-Iav-CaM அணைவு), EMD-49846 (நிகோடினமைடு மற்றும் EDTA உடன் கூடிய Nan-Iav-CaM அணைவு), EMD-49847 (அஃபிடோபைரோலின் மற்றும் கால்சியத்துடன் கூடிய Nan-Iav-CaM அணைவு), EMD-49848 (அஃபிடோபைரோலின் மற்றும் EDTA உடன் கூடிய Nan-Iav-CaM அணைவு), மற்றும் EMD-49849 (அஃபிடோபைரோலினுடன் கூடிய Nan பென்டாமர் அணைவு). செயல்பாட்டுப் பகுப்பாய்விற்கான மூலத் தரவுகள் இந்தக் கட்டுரையில் வழங்கப்பட்டுள்ளன.
பதிவிட்ட நேரம்: ஜனவரி 28, 2026
