உலகளாவிய உணவுப் பற்றாக்குறையை நிவர்த்தி செய்வதிலும், நோய்க்கிருமிகளால் பரவும் மனித நோய்களை எதிர்த்துப் போராடுவதிலும் பூச்சிக்கொல்லிகள் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன. இருப்பினும், பூச்சிக்கொல்லி எதிர்ப்பின் வளர்ந்து வரும் பிரச்சனைக்கு, பயன்படுத்தப்படாத இலக்குகளை குறிவைக்கும் புதிய சேர்மங்களைக் கண்டுபிடிப்பது அவசரமாக தேவைப்படுகிறது. பூச்சி நிலையற்ற ஏற்பி ஆற்றல் (TRPV) சேனல்கள் - நான்சோங் (நான்) மற்றும் செயலற்ற (ஐஏவி) - ஹீட்டோரோலோகஸ் சேனல்களை (நான்-ஐஏவி) உருவாக்கி, பூச்சிகளில் புவி வெப்பமடைதல், கேட்டல் மற்றும் புரோபிரியோசெப்சனை மத்தியஸ்தம் செய்யும் இயந்திர உணர்வு உறுப்புகளுக்கு இடமளிக்கலாம். அஃபிடோபைரோலிடோன் (ஏபி) போன்ற சில பூச்சிக்கொல்லிகள், அறியப்படாத வழிமுறைகள் மூலம் நான்-ஐஏவியை குறிவைக்கின்றன. துளையிடும்-உறிஞ்சும் பூச்சிகளுக்கு (ஹெமிப்டெரான்கள்) எதிராக AP பயனுள்ளதாக இருக்கும், இது இழைகளின் செயல்பாட்டை சீர்குலைப்பதன் மூலம் உணவளிப்பதைத் தடுக்கிறது. AP நானுடன் மட்டுமே பிணைக்க முடியும், ஆனால் நான்-ஐஏவி மட்டுமே எண்டோஜெனஸ் நிகோடினமைடு (NAM) உட்பட அகோனிஸ்டுகளுடன் தொடர்பு கொள்ள முடியும், இதன் மூலம் சேனல் செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்துகிறது. பூச்சிக்கொல்லி இலக்காக நான்-ஐஏவியின் திறன் இருந்தபோதிலும், அதன் சேனல் அசெம்பிளி, ஒழுங்குமுறை பிணைப்பு தளங்கள் மற்றும் Ca2+-சார்ந்த ஒழுங்குமுறை பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை, இது மேலும் பூச்சிக்கொல்லி வளர்ச்சியைத் தடுக்கிறது. இந்த ஆய்வில், கால்மோடுலின்-லிகண்ட்-இல்லாத நிலையில் ஹெமிப்டெரா பூச்சிகளில் நான்-ஐஏவின் கட்டமைப்பைத் தீர்மானிக்க கிரையோ-எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி பயன்படுத்தப்பட்டது, அதே போல் அன்கைரின் ரிபீட் சைட்டோபிளாஸ்மிக் டொமைனின் (ARD) எல்லையில் AP மற்றும் NAM உடன். ஆச்சரியப்படும் விதமாக, நான் புரதமே ஒரு பென்டாமரை உருவாக்க முடியும் என்பதைக் கண்டறிந்தோம், இது AP-மத்தியஸ்த ARD தொடர்புகளால் உறுதிப்படுத்தப்படுகிறது. இந்த ஆய்வு பூச்சிக்கொல்லிகள் மற்றும் அகோனிஸ்டுகள் மற்றும் நான்-ஐஏவ் இடையேயான மூலக்கூறு தொடர்புகளை வெளிப்படுத்துகிறது, இது சேனல் செயல்பாடு மற்றும் அசெம்பிளியில் ARD இன் முக்கியத்துவத்தை எடுத்துக்காட்டுகிறது, மேலும் Ca2+ ஒழுங்குமுறையின் பொறிமுறையை ஆராய்கிறது.
அதிகரித்து வரும் கடுமையான உலகளாவிய காலநிலை மாற்றத்தின் பின்னணியில், மோசமடைந்து வரும் உலகளாவிய உணவுப் பாதுகாப்பு 21 ஆம் நூற்றாண்டின் முக்கிய சவால்களில் ஒன்றாகும், இது சமூகத்திற்கு தொடர்ச்சியான விளைவுகளை ஏற்படுத்துகிறது.1,2, 1,2,உலக சுகாதார அமைப்பின் உலகில் உணவுப் பாதுகாப்பு மற்றும் ஊட்டச்சத்து நிலை 2023 (SOFI) அறிக்கை, உலகளவில் சுமார் 2.33 பில்லியன் மக்கள் மிதமானது முதல் கடுமையானது வரையிலான உணவுப் பாதுகாப்பின்மையால் பாதிக்கப்பட்டுள்ளனர், இது நீண்டகாலப் பிரச்சினையாகும்.3,4, 3,4, 3, 4, 5, 6, 8, 1, 1, 2, 3, 4, 5, 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6துரதிர்ஷ்டவசமாக, ஆண்டுதோறும் 20% முதல் 30% அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட பயிர் விளைச்சல் பூச்சிகள் மற்றும் நோய்க்கிருமிகளால் இழக்கப்படுகிறது, மேலும் புவி வெப்பமடைதல் பூச்சி எதிர்ப்பு மற்றும் பயிர் பாதிப்பை அதிகரிக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது.4,5,6,7,8,பூச்சிக்கொல்லி மேம்பாடு, பயிர்களை பூச்சிகளிடமிருந்து பாதுகாப்பதற்கும், நோய்க்கிருமிகளால் பரவும் நோய்க்கிருமிகளின் பரவலைக் குறைப்பதற்கும் மட்டுமல்லாமல், டெங்கு காய்ச்சல், மலேரியா மற்றும் சாகஸ் நோய் போன்ற நோய்க்கிருமிகளால் பரவும் மனித நோய்களை எதிர்த்துப் போராடுவதற்கும் மிக முக்கியமானது, ஏனெனில் அவை பூச்சிக்கொல்லிகளுக்கு அதிகளவில் எதிர்ப்புத் திறன் கொண்டவை.5,9,10,11,
நியூரோடாக்ஸிக் பூச்சிக்கொல்லிகளின் முக்கிய இலக்குகளில், ஹெட்டோரோடெட்ராமெரிக் TRPV சேனல் நான்சுங் (நான்)-இனாக்டிவ் (ஐஏவி) கடந்த தசாப்தத்தில் மட்டுமே கண்டுபிடிக்கப்பட்ட பூச்சிக்கொல்லி இலக்குகளின் ஒரு வகையை குறிக்கிறது, இதில் இமிடாக்ளோபிரிட் மற்றும் பைராக்ளோஸ்ட்ரோபின் போன்ற வணிக ரீதியாக கிடைக்கக்கூடிய பூச்சிக்கொல்லிகள் அடங்கும்.12,13,14,அரை-செயற்கை பூச்சிக்கொல்லி அஃபிடோபைரோலிஃபென் (AP) என்பது சமீபத்தில் உருவாக்கப்பட்டு வணிகமயமாக்கப்பட்ட ஒரு தயாரிப்பு ஆகும், இதன் முக்கிய கூறு செயலில் உள்ள பூச்சிக்கொல்லியான இன்ஸ்காலிஸ்® ஆகும், இது AP ஐ துணை நானோமோலார் செயல்பாட்டு மட்டத்தில் பிணைக்கிறது.15மகரந்தச் சேர்க்கையாளர்கள், நன்மை பயக்கும் பூச்சிகள் மற்றும் பிற இலக்கு அல்லாத உயிரினங்களுக்கு AP குறைந்த கடுமையான நச்சுத்தன்மையைக் காட்டுகிறது, மேலும் லேபிள் அறிவுறுத்தல்களின்படி பயன்படுத்தும்போது, அது மற்ற பூச்சிக்கொல்லிகளுக்கு எதிர்ப்பு அழுத்தத்தைக் குறைக்கும்.16,17,18நான் மற்றும் ஐவ் பூச்சி இனங்கள் முழுவதும் பரவலாக விநியோகிக்கப்படுகின்றன, ஆண்டெனாக்கள் மற்றும் கைகால்களின் நாண் நீட்சி ஏற்பி நியூரான்களில் மட்டுமே இணைந்து வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன, மேலும் அவை கேட்டல், ஈர்ப்பு உணர்தல் மற்றும் புரோபிரியோசெப்சனுக்கு முக்கியமானவை.13,16,19,20,21,22AP, இமிடாக்ளோபிரிட் மற்றும் பைராக்ளோஸ்ட்ரோபின் ஆகியவை நான்-ஐவ் வளாகத்தை ஒரு தனித்துவமான பொறிமுறையின் மூலம் தூண்டுகின்றன, இறுதியில் புரோபிரியோசெப்டிவ் சிக்னல் கடத்தலைத் தடுக்கின்றன.13,16,23அசுவினிகள் மற்றும் வெள்ளை ஈக்கள் போன்ற துளையிட்டு உறிஞ்சும் பூச்சிகளில் (ஹெமிப்டெரான்கள்), புரோபிரியோசெப்ஷன் இழப்பு அவற்றின் உண்ணும் திறனைப் பாதிக்கிறது, இறுதியில் மரணத்திற்கு வழிவகுக்கிறது.13,24, 13,24, 13,சுவாரஸ்யமாக, AP, நான்-ஐவ் வளாகத்திற்கு அதிக ஈடுபாட்டையும், நானுக்கு மட்டும் குறைந்த ஈடுபாட்டையும் வெளிப்படுத்துகிறது. AP ஐ நான்-ஐவ் உடன் பிணைப்பது ஒரு மின்சாரத்தைத் தூண்டுகிறது, ஆனால் நானுடன் மட்டும் பிணைப்பது சேனல் செயல்பாட்டைத் தூண்டுவதில்லை. ஐவ் தானே AP உடன் பிணைக்கவே இல்லை.16இது நான் மற்றும் ஐவ் பிணைந்து வெவ்வேறு நான்-ஐவ் சேனல் வளாகங்களை உருவாக்கக்கூடும் (எ.கா., வெவ்வேறு ஸ்டோச்சியோமெட்ரிக் விகிதங்கள் அல்லது ஒரே ஸ்டோச்சியோமெட்ரிக் விகிதத்திற்குள் வெவ்வேறு ஏற்பாடுகளுடன்) அல்லது ஏபி பல தளங்களுடன் பிணைக்கப்படலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது. மேலும், இயற்கை அகோனிஸ்ட் நிகோடினமைடு (NAM) டிரோசோபிலா நான்-ஐவ் உடன் மைக்ரோமோலார் தொடர்புடன் பிணைக்கிறது, இது விட்ரோவில் அஃபிட்கள் (AP) போன்ற விளைவுகளை வெளிப்படுத்துகிறது.16,25 (ஆங்கிலம்)மற்றும் அசுவினி இனப்பெருக்கம் மற்றும் உணவைத் தடுக்கிறது, இறுதியில் அவற்றின் மரணத்திற்கு வழிவகுக்கிறது.25,26, 25,. இந்தத் தரவுகள் பல கேள்விகளை எழுப்புகின்றன. எடுத்துக்காட்டாக, நான்-ஐஏவி ஹெட்டோரோடைமர் எவ்வாறு உருவாகிறது, எந்த பிணைப்பு தளங்கள் சிறிய மூலக்கூறுகளை மாற்றியமைக்கப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, மேலும் இந்த சிறிய மூலக்கூறுகள் புரோபிரியோசெப்ஷனை அடக்குவதன் மூலம் சேனல் செயல்பாட்டை எவ்வாறு ஒழுங்குபடுத்துகின்றன என்பது தெளிவாகத் தெரியவில்லை. மேலும், நான்-ஐஏவி ஹெட்டோரோடைமர் செயலில் உள்ளது மற்றும் ஏபியை அதிக ஈடுபாட்டுடன் பிணைக்கும் அதே வேளையில், நான் செயலற்றதாகவும் AP க்கு குறைந்த ஈடுபாட்டைக் கொண்டிருப்பதற்கான காரணங்கள் தெளிவாகத் தெரியவில்லை. இறுதியாக, நான்-ஐஏவி செயல்பாட்டின் Ca2+-சார்ந்த ஒழுங்குமுறை மற்றும் அது எவ்வாறு நரம்பியல் சமிக்ஞை செயல்முறைகளில் ஒருங்கிணைக்கப்படுகிறது என்பது பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை.13,21.
இந்த ஆய்வில், கிரையோ-எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி, மின் இயற்பியல் மற்றும் ரேடியோலிகண்ட் பிணைப்பு நுட்பங்களை இணைத்து, நான்-ஐஏவின் கூட்டத்தையும், சிறிய மூலக்கூறு கட்டுப்பாட்டாளர்களுடன் அதன் பிணைப்பின் பொறிமுறையையும் நாங்கள் தெளிவுபடுத்தினோம். மேலும், ஐஏவி மற்றும் ஏபி-நிலைப்படுத்தப்பட்ட நான் பென்டாமர்களுடன் அமைப்பு ரீதியாக பிணைக்கப்பட்ட கால்மோடூலின் (CaM) ஐஏவியைக் கண்டறிந்தோம். இந்த முடிவுகள் சேனல்களில் கால்சியம் அயனிகளின் ஒழுங்குமுறை, சேனல் அசெம்பிளி மற்றும் லிகண்ட் பிணைப்பு உறவை தீர்மானிக்கும் காரணிகள் பற்றிய முக்கியமான நுண்ணறிவுகளை வழங்குகின்றன. மிக முக்கியமாக, இந்த செயல்முறைகளில் ARD ஒரு முக்கிய பங்கை வகிக்கிறது என்பதை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம். தொடர்புடைய விவசாய பூச்சிக்கொல்லிகளுடன் பிணைக்கப்பட்ட முழுமையான பூச்சி சேனல்கள் பற்றிய எங்கள் ஆய்வு.27, 28, 29பூச்சிக்கொல்லித் துறையின் வளர்ச்சிக்கான வாய்ப்புகளைத் திறக்கிறது, பூச்சிக்கொல்லிகளின் செயல்திறன் மற்றும் தனித்தன்மையை மேம்படுத்துகிறது, மேலும் உலகளாவிய உணவுப் பாதுகாப்பு மற்றும் நோய்க்கிருமிகளால் பரவும் நோய்களின் பரவலை நிவர்த்தி செய்ய TRPV-இலக்கு கலவைகளை பிற உயிரினங்களுக்குப் பயன்படுத்த உதவுகிறது.
நான்-ஐஏவி Ca2+ ஆல் ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது என்பதையும், ஒழுங்குமுறை வழிமுறை அமைப்பு ரீதியாக பிணைக்கப்பட்ட CaM ஆல் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுவதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். முக்கியமாக, CaM ஆல் Nav இன் இந்த Ca2+-சார்ந்த ஒழுங்குமுறை மற்ற அயனி சேனல்களின் ஒழுங்குமுறை வழிமுறைகளிலிருந்து (எ.கா., மின்னழுத்த-கேட்டட் Na+ சேனல்கள் மற்றும் TRPV5/6 சேனல்கள்) கணிசமாக வேறுபடுகிறது.52,53,54,55,56,57. Nav1.2 சேனலில், CaM இன் C-முனைய டொமைன், C-முனைய டொமைனுடன் (CTD) ஹெலிகலாக இணைக்கிறது, மேலும் Ca2+ அதன் N-முனைய டொமைனை CTD இன் தொலைதூர பகுதியுடன் பிணைப்பைத் தூண்டுகிறது.56. TRPV5/6 சேனலில், CaM இன் C-முனைய டொமைன் CTH உடன் பிணைக்கிறது, மேலும் Ca2+ அதன் N-முனைய டொமைனை துளைக்குள் மேல்நோக்கி நீட்டிக்க தூண்டுகிறது, இதன் மூலம் கேஷன் ஊடுருவலைத் தடுக்கிறது.53,54 (ஆங்கிலம்). Nan-Iav-CaM இன் Ca2+-ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட செயல்பாட்டிற்கான ஒரு மாதிரியை நாங்கள் முன்மொழிகிறோம் (படம் 4h). இந்த மாதிரியில், CaM இன் N-முனைய டொமைன் Iav இன் C-முனைய டொமைனுடன் (CTH) அமைப்பு ரீதியாக பிணைக்கிறது. ஓய்வு நிலையில் (குறைந்த [Ca2+] செறிவு), CaM இன் C-முனைய டொமைன் Nan உடன் தொடர்பு கொள்கிறது, ARD இணக்கத்தை உறுதிப்படுத்துகிறது மற்றும் அதன் மூலம் சேனல் திறப்பை ஊக்குவிக்கிறது. சேனலுடன் ஒரு அகோனிஸ்ட்/பூச்சிக்கொல்லியை பிணைப்பது துளை திறப்பைத் தூண்டுகிறது, இது Ca2+ வருகைக்கு வழிவகுக்கிறது. பின்னர் Ca2+ CaM உடன் பிணைக்கிறது, இதனால் Nan இன் ARD இலிருந்து C-முனைய டொமைனின் விலகல் ஏற்படுகிறது. CaM பிணைப்பைத் தடுப்பது அடிப்படையில் Ca2+ இன் தடுப்பு விளைவை நீக்குவதால், இந்த விலகல் ARD இயக்கத்தை மாற்றியமைக்கிறது, இதன் மூலம் Ca2+-சார்ந்த தடுப்பு அல்லது உணர்திறன் நீக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. கால்சியம் அயன் நீக்கத்திற்குப் பிறகு சேனல் நீரோட்டங்களின் விரைவான மீட்பு (படம் 4g) இந்த வழிமுறை Ca2+-மத்தியஸ்த நரம்பியல் சமிக்ஞைகளுக்கு விரைவான பதில்களை எளிதாக்குகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. மேலும், இன்னும் சரியாகப் புரிந்து கொள்ளப்படாத ஐஏவியின் சி-முனையப் பகுதி, சேனல் இலக்கு மற்றும் தற்போதைய ஒழுங்குமுறையில் பிற பாத்திரங்களை வகிப்பதாக அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது.21
இறுதியாக, எங்கள் ஆய்வு விவசாய முக்கியத்துவம் வாய்ந்த ஒரு பூச்சிக்கொல்லி-பூச்சிக்கொல்லி TRP சேனல் வளாகத்தின் உயர் தெளிவுத்திறன் அமைப்பை முன்வைக்கிறது - இது முன்னர் நமக்குத் தெரியாத ஒரு கண்டுபிடிப்பு. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், பூச்சி செல்களை விட மனித செல்களில் (HEK293S GnTi–) பூச்சி சேனலின் அமைப்பு மற்றும் செயல்பாட்டை நாங்கள் வகைப்படுத்தினோம். வளர்ந்து வரும் பூச்சிக்கொல்லி எதிர்ப்பு மற்றும் உணவுப் பாதுகாப்பு மற்றும் நோய்க்கிருமிகள் மீதான தொடர்ச்சியான அழுத்தத்தை எதிர்கொண்டு, மனித ஆரோக்கியம் மற்றும் உலகளாவிய உணவுப் பாதுகாப்பின் நலனுக்காக புதிய பூச்சிக்கொல்லிகளை உருவாக்குவதை எளிதாக்கும் முக்கியமான தகவல்களை எங்கள் பணி வழங்குகிறது. லேபிள் அறிவுறுத்தல்களின்படி பயன்படுத்தப்படும்போது AP போன்ற பூச்சிக்கொல்லிகள் சில பூச்சிகளுக்கு எதிராக பயனுள்ளதாக இருக்கும் என்றும், நன்மை பயக்கும் மகரந்தச் சேர்க்கையாளர்களுக்கு குறைந்த கடுமையான நச்சுத்தன்மையைக் கொண்டிருப்பதாகவும் ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன, இது அவற்றின் சுற்றுச்சூழல் பாதுகாப்பை நிரூபிக்கிறது.13,16, 13,மேலும், சில AP வழித்தோன்றல்களை கொசுக்கள் மீது சோதனை செய்ததில், அவை இறுதியில் பறக்கும் திறனை இழக்கின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. இந்த மாடுலேட்டிங் சேர்மங்கள் நான்-ஐவ் உடன் எவ்வாறு பிணைக்கப்படுகின்றன என்பதைப் புரிந்துகொள்வது, ஏற்கனவே உள்ள சேர்மங்களை மாற்றியமைக்க அல்லது புதிய சேர்மங்களை உருவாக்குவதை எளிதாக்கும்.துல்லியமானபூச்சி கட்டுப்பாடு. நான்-ஐவ் ARD இடைமுகம் எண்டோஜெனஸ் சேர்மங்கள், பூச்சிக்கொல்லிகள் மற்றும் Ca2+-CaM ஆகியவற்றின் செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துவதற்கு மட்டுமல்லாமல், சேனல் அசெம்பிளிக்கும் முக்கியமானது என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது. சிறிய மூலக்கூறுகளுடன் ஹெட்டோரோடைமர் அசெம்பிளியை சீர்குலைப்பது அயன் சேனல் தடுப்பான்களை உருவாக்குவதற்கான ஒரு தனித்துவமான மற்றும் நம்பிக்கைக்குரிய அணுகுமுறையாக இருக்கலாம் என்று நாங்கள் பரிந்துரைக்கிறோம்.
எட்டு ஆர்த்தோலோகஸ் மரபணுக்களில், பழுப்பு வண்டு (ஹாலியோமார்பா ஹாலிஸ்) நான்சுங் மற்றும் இன்ஆக்டிவ் ஆகியவற்றின் முழு நீள மரபணுக்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன, அவை சவர்க்காரங்களில் சிறந்த நிலைத்தன்மையைக் காட்டின. தொகுக்கப்பட்ட மரபணுக்கள் மனித வெளிப்பாட்டிற்காக கோடான்-உகந்ததாக்கப்பட்டு XhoI மற்றும் EcoRI கட்டுப்பாட்டு தளங்களைப் பயன்படுத்தி pBacMam pCMV-DEST வெக்டரில் (லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) குளோன் செய்யப்பட்டன. இது குளோன்கள் C-டெர்மினல் GFP-FLAG-10xHis மற்றும் mCherry-FLAG-10xHis குறிச்சொற்களுடன் சட்டத்தில் இருப்பதை உறுதிசெய்தது, அவை HRC-3C புரோட்டீஸ் (PPX) மூலம் பிளவுபடுகின்றன, இது சுயாதீனமானதை அனுமதிக்கிறது.வெளிப்பாடுநான்சுங் மற்றும் இன்ஆக்டிவ் ஆகியவற்றை pBacMam வெக்டரில் குளோன் செய்யப் பயன்படுத்தப்பட்ட ப்ரைமர்கள் பின்வருமாறு:
K3 கேமரா மற்றும் கட்டான் பயோகுவாண்டம் ஆற்றல் வடிகட்டி பொருத்தப்பட்ட டைட்டன் கிரியோஸ் G2 டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கியில் (FEI) தனிப்பட்ட துகள்களின் நுண்ணிய படங்கள் பெறப்பட்டன. இந்த நுண்ணோக்கி 300 keV இல் இயக்கப்பட்டது, 20 eV ஆற்றல் அமைப்பு, மாதிரி பிக்சல் அளவு 1.08 Å/பிக்சல் (பெயரளவு உருப்பெருக்கம் 81,000x), மற்றும் -0.8 முதல் -2.2 μm வரையிலான குவியக் குறைப்பு. 25 e–px−1 s−1 என்ற பெயரளவு டோஸ் வீதம், 2.4 வினாடிகள் வெளிப்பாடு நேரம் மற்றும் தோராயமாக 60 e–Å−2 மொத்த டோஸ் கொண்ட அட்சரேகை S நுண்ணோக்கி (கட்டான்) ஐப் பயன்படுத்தி வினாடிக்கு 40 பிரேம்களில் வீடியோ பதிவு செய்யப்பட்டது.
RELION 4.061 இல் MotionCor2 ஐப் பயன்படுத்தி படலத்தில் பீம்-தூண்டப்பட்ட இயக்க திருத்தம் மற்றும் டோஸ் எடையிடல் ஆகியவை செய்யப்பட்டன. பேட்ச்-அடிப்படையிலான CTF மதிப்பீட்டு முறையைப் பயன்படுத்தி cryoSPARC இல் கான்ட்ராஸ்ட் டிரான்ஸ்ஃபர் செயல்பாடு (CTF) அளவுரு மதிப்பீடு செய்யப்பட்டது62. CTF பொருத்துதல் தெளிவுத்திறன் ≥4 Å கொண்ட ஃபோட்டோமைக்ரோகிராஃப்கள் அடுத்தடுத்த பகுப்பாய்விலிருந்து விலக்கப்பட்டன. பொதுவாக, cryoSPARC இல் புள்ளித் தேர்வுக்கு 500–1000 ஃபோட்டோமைக்ரோகிராஃப்களின் துணைக்குழு பயன்படுத்தப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து வார்ப்புரு அடிப்படையிலான துகள் தேர்வுக்கான தெளிவான குறிப்பு படத்தைப் பெற வடிகட்டிய பிறகு 2D வகைப்பாட்டின் பல சுற்றுகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. பின்னர் 64-பிக்சல் எல்லை பெட்டிகள் மற்றும் 4-மடிப்பு பின்னிங் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி துகள்கள் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. தேவையற்ற துகள் வகைகளை அகற்ற 2D வகைப்பாட்டின் பல சுற்றுகள் செய்யப்பட்டன. ஆரம்ப 3D மாதிரி ab initio மறுகட்டமைப்பைப் பயன்படுத்தி மறுகட்டமைக்கப்பட்டது மற்றும் cryoSPARC இல் சீரற்ற சுத்திகரிப்பைப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்பட்டது. ARD பன்முகத்தன்மையின் அடிப்படையில் cryoSPARC அல்லது RELION இல் 3D வகைப்பாடு செய்யப்பட்டது. சவ்வு களங்களின் குறிப்பிடத்தக்க பன்முகத்தன்மை எதுவும் காணப்படவில்லை. C1 மற்றும் C2 முறைகளைப் பயன்படுத்தி துகள்கள் சுத்திகரிக்கப்பட்டன; அதிக C2 தெளிவுத்திறன் கொண்ட துகள்கள் C2 ஐப் பொறுத்தவரை சமச்சீராகக் கருதப்பட்டு, பேய்சியன் சுத்திகரிப்புக்காக RELION இல் இறக்குமதி செய்யப்பட்டன. பின்னர் துகள்கள் இறுதி சீரற்ற மற்றும் உள்ளூர் சுத்திகரிப்புக்காக மீண்டும் கிரையோஸ்பார்க்கிற்கு மாற்றப்பட்டன. இறுதித் தெளிவுத்திறன் மற்றும் துகள் எண்ணிக்கைகள் அட்டவணை 1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன.
Nan+AP பென்டாமர்களைச் செயலாக்கும்போது, சவ்வு களங்களின் (குறிப்பாக துளைப் பகுதி) தெளிவுத்திறனை மேம்படுத்துவதற்கான பல்வேறு முறைகளை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம், அதாவது சமிக்ஞை கழித்தல் மற்றும் TMD மறைத்தல். இருப்பினும், துளைப் பகுதியில் ஏற்படக்கூடிய தீவிர கோளாறு மற்றும் TMD இன் ஒட்டுமொத்த பன்முகத்தன்மை காரணமாக இந்த முயற்சிகள் தோல்வியடைந்தன. இறுதித் தெளிவுத்திறன், கிரையோஸ்பார்க்கில் சீரற்ற செயலாக்க முறையால் தானாக உருவாக்கப்பட்ட முகமூடியைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது, இது முதன்மையாக ARD பகுதியை இலக்காகக் கொண்டது. இது சவ்வு களங்களை விட (குறிப்பாக VSLD பகுதி) கணிசமாக அதிக தெளிவுத்திறனை அடைந்தது.
நான்சுங் மற்றும் செயலற்ற பிழைகளின் apo வடிவங்களின் ஆரம்பகால புதிய மாதிரிகள் முதலில் Coot63 ஐப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டன, மேலும் Nan மற்றும் Iav பிழைகளின் மாதிரிகள் குறைந்த நம்பிக்கை பகுதிகளை அடையாளம் காண AlphaFold264 ஐப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டன. கால்மோடுலின் மாதிரியாக்கம் முறையே PDB அணுகல்கள் 4JPZ56 மற்றும் 1CFD65 இல் Ca2+-பிணைப்பு மற்றும் Ca2+-இலவச மாதிரிகளின் திடமான-உடல் பொருத்தங்களை அடிப்படையாகக் கொண்டது. சரியான ஸ்டீரியோ கெமிஸ்ட்ரி மற்றும் நல்ல வடிவவியலை உறுதி செய்வதற்காக கோள சுத்திகரிப்பு மூலம் மாதிரிகள் சுத்திகரிக்கப்பட்டன. பாஸ்பாடிடைல்கோலின், பாஸ்பாடிடைலெத்தனோலமைன் மற்றும் பாஸ்பாடிடைல்செரின் ஆகியவை பின்னர் நன்கு வரையறுக்கப்பட்ட லிப்பிட் அடர்த்திகளாக மாதிரியாக்கப்பட்டன, மேலும் NAM மற்றும் AP லிகண்ட்கள் இறுக்கமான சந்திப்புகளில் தொடர்புடைய அடர்த்திகளில் வைக்கப்பட்டன. PHENIX66 இல் eLBOW ஐப் பயன்படுத்தி ஐசோஃபார்ம்களின் SMILES சரத்திலிருந்து கட்டுப்பாட்டு கோப்புகள் உருவாக்கப்பட்டன. இறுதியாக, மாதிரிகள் PHENIX இல் உள்ள உண்மையான இடத்தில் உள்ளூர் கட்ட தேடல் மற்றும் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு கட்டுப்பாடுகளுடன் உலகளாவிய குறைப்பைப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்பட்டன. மாதிரி சுத்திகரிப்பு மற்றும் கட்டமைப்பு பகுப்பாய்விற்கு MolProbity சேவையகம் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் PyMOL மற்றும் UCSF Chimera X ஐப் பயன்படுத்தி விளக்கப்படங்கள் செய்யப்பட்டன. 67,68,69 HOLE சேவையகத்தைப் பயன்படுத்தி துளை பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, 70 மற்றும் Consurf சேவையகத்தைப் பயன்படுத்தி வரிசை பாதுகாப்பு மேப்பிங் செய்யப்பட்டது.71
இகோர் ப்ரோ 6.2, எக்செல் ஆபிஸ் 365 மற்றும் கிராப்பேட் பிரிசம் 7.0 ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. அனைத்து அளவு தரவுகளும் சராசரி ± நிலையான பிழையாக (SEM) வழங்கப்படுகின்றன. இரண்டு குழுக்களை ஒப்பிடுவதற்கு மாணவரின் t-சோதனை (இரு-வால், இணைக்கப்படாதது) பயன்படுத்தப்பட்டது. பல குழுக்களை ஒப்பிடுவதற்கு மாறுபாட்டின் ஒரு-வழி பகுப்பாய்வு (ANOVA) மற்றும் அதைத் தொடர்ந்து டன்னெட்டின் பிந்தைய தற்காலிக சோதனை பயன்படுத்தப்பட்டது. *P< 0.05, ** ப< 0.01, மற்றும் ***Pதரவு பரவலைப் பொறுத்து < 0.001 புள்ளிவிவர ரீதியாக முக்கியத்துவம் வாய்ந்ததாகக் கருதப்பட்டது. Kd, Ki மதிப்புகள் மற்றும் அவற்றின் சமச்சீரற்ற 95% நம்பிக்கை இடைவெளிகள் கிராப்பேட் பிரிசம் 10 ஐப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன.
ஆய்வு முறை பற்றிய கூடுதல் விவரங்களுக்கு, இந்தக் கட்டுரையில் இணைக்கப்பட்டுள்ள நேச்சர் போர்ட்ஃபோலியோ அறிக்கை சுருக்கத்தைப் பார்க்கவும்.
ஆரம்ப மாதிரி PDB 4JPZ மற்றும் 1CFD தரவுத்தளங்களிலிருந்து கால்மோடூலின் மாதிரிகளைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டது. ஆயத்தொலைவுகள் புரத தரவு வங்கியில் (PDB) அணுகல் எண்கள் 9NVN (லிகண்ட் இல்லாமல் Nan-Iav-CaM), 9NVO (நிகோடினமைடுடன் Nan-Iav-CaM பிணைக்கப்பட்டுள்ளது), 9NVP (நிகோடினமைடு மற்றும் EDTA உடன் Nan-Iav-CaM பிணைக்கப்பட்டுள்ளது), 9NVQ (அஃபெனிடோல்பைரோலின் மற்றும் கால்சியத்துடன் Nan-Iav-CaM பிணைக்கப்பட்டுள்ளது), 9NVR (அஃபெனிடோல்பைரோலின் மற்றும் EDTA உடன் Nan-Iav-CaM பிணைக்கப்பட்டுள்ளது), மற்றும் 9NVS (அஃபெனிடோல்பைரோலின் உடன் Nan பென்டாமர் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது) ஆகியவற்றின் கீழ் டெபாசிட் செய்யப்பட்டுள்ளன. தொடர்புடைய கிரையோ-எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி படங்கள் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி தரவுத்தளத்தில் (EMDB) பின்வரும் அணுகல் எண்களின் கீழ் வைக்கப்பட்டுள்ளன: EMD-49844 (லிகண்ட் இல்லாமல் Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (நிகோடினமைடுடன் Nan-Iav-CaM காம்ப்ளக்ஸ்), EMD-49846 (நிகோடினமைடு மற்றும் EDTA உடன் Nan-Iav-CaM காம்ப்ளக்ஸ்), EMD-49847 (அஃபிடோபிரோரோலின் மற்றும் கால்சியத்துடன் Nan-Iav-CaM காம்ப்ளக்ஸ்), EMD-49848 (அஃபிடோபிரோரோலின் மற்றும் EDTA உடன் Nan-Iav-CaM காம்ப்ளக்ஸ்), மற்றும் EMD-49849 (அஃபிடோபிரோரோலின் கொண்ட Nan பென்டாமர் காம்ப்ளக்ஸ்). செயல்பாட்டு பகுப்பாய்விற்கான மூல தரவு இந்த ஆய்வறிக்கையில் வழங்கப்பட்டுள்ளது.
இடுகை நேரம்: ஜனவரி-28-2026