குடற்புழு நீக்கும் மருந்தான N,N-டைஎத்தில்-m-டொலுஅமைடு (டீட்DEET, AChE (அசிடைல்கோலினெஸ்டரேஸ்) நொதியைத் தடுப்பதாகவும், அதிகப்படியான இரத்த நாள உருவாக்கம் காரணமாக புற்றுநோயை உண்டாக்கும் பண்புகளைக் கொண்டிருப்பதாகவும் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது. இந்த ஆய்வறிக்கையில், DEET குறிப்பாக இரத்த நாள உருவாக்கத்தை ஊக்குவிக்கும் எண்டோதீலியல் செல்களைத் தூண்டி, அதன் மூலம் கட்டி வளர்ச்சியை அதிகரிக்கிறது என்பதை நாங்கள் காட்டுகிறோம். DEET, பெருக்கம், இடம்பெயர்வு மற்றும் ஒட்டுதல் உள்ளிட்ட இரத்த நாள உருவாக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும் செல்லுலார் செயல்முறைகளைச் செயல்படுத்துகிறது. இது எண்டோதீலியல் செல்களில் அதிகரித்த NO உற்பத்தி மற்றும் VEGF வெளிப்பாட்டுடன் தொடர்புடையது. M3-ஐ செயலிழக்கச் செய்வது அல்லது மருந்தியல் ரீதியான M3 தடுப்பான்களைப் பயன்படுத்துவது இந்த விளைவுகள் அனைத்தையும் நீக்கியது, இது DEET-ஆல் தூண்டப்பட்ட இரத்த நாள உருவாக்கம் M3-உணர்திறன் கொண்டது என்பதைக் காட்டுகிறது. M3 ஏற்பிகளை அதிகமாக வெளிப்படுத்தும் எண்டோதீலியல் மற்றும் HEK செல்களில் கால்சியம் சமிக்ஞை தொடர்பான சோதனைகள், அத்துடன் பிணைப்பு மற்றும் இணைப்பு ஆய்வுகள், DEET ஆனது M3 ஏற்பிகளின் ஒரு அல்லோஸ்டெரிக் மாடுலேட்டராகச் செயல்படுகிறது என்பதைக் குறிப்பிடுகின்றன. மேலும், DEET ஆனது AChE-ஐத் தடுக்கிறது, அதன் மூலம் அசிடைல்கோலினின் உயிரியல் கிடைக்கும் தன்மையையும், அது M3 ஏற்பிகளுடன் பிணைவதையும் அதிகரித்து, அல்லோஸ்டெரிக் ஒழுங்குமுறை மூலம் இரத்த நாள உருவாக்க விளைவுகளை மேம்படுத்துகிறது.
சுவிஸ் எலிகளின் பெருந்தமனியிலிருந்து முதன்மை EC-கள் தனிமைப்படுத்தப்பட்டன. பிரித்தெடுக்கும் முறையானது கோபயாஷி நெறிமுறை 26-இலிருந்து தழுவி எடுக்கப்பட்டது. எலி EC-கள், நான்காவது தலைமுறை வரை 5% வெப்பத்தால் செயலற்றதாக்கப்பட்ட FBS சேர்க்கப்பட்ட EBM-2 ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்டன.
HUVEC, U87MG, அல்லது BF16F10 ஆகியவற்றின் பெருக்கத்தில் DEET-இன் இரண்டு செறிவுகளின் விளைவு, CyQUANT செல் பெருக்க மதிப்பீட்டுக் கருவித் தொகுப்பைப் (Molecular Probes, C7026) பயன்படுத்திப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, ஒரு 96-குழித் தட்டில் ஒவ்வொரு குழிக்கும் 5.103 செல்கள் விதைக்கப்பட்டு, இரவு முழுவதும் ஒட்டிக்கொள்ள அனுமதிக்கப்பட்டு, பின்னர் 24 மணி நேரத்திற்கு DEET கொண்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது. வளர்ச்சி ஊடகத்தை அகற்றிய பிறகு, நுண்தட்டின் ஒவ்வொரு குழியிலும் சாயப் பிணைப்புக் கரைசல் சேர்க்கப்பட்டு, செல்கள் 37 °C வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டன. 485 nm கிளர்வு வடிகட்டிகள் மற்றும் 530 nm உமிழ்வு வடிகட்டிகள் பொருத்தப்பட்ட மித்ராஸ் LB940 பல்முனை நுண்தட்டு வாசிப்பானைப் (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) பயன்படுத்தி ஒளிர்வு நிலைகள் தீர்மானிக்கப்பட்டன.
HUVEC செல்கள் 96-குழித் தட்டுகளில், ஒரு குழிக்கு 104 செல்கள் என்ற அடர்த்தியில் இடப்பட்டன. செல்களுக்கு 24 மணி நேரத்திற்கு DEET கொண்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது. நிறமானி MTT சோதனை (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், M5655) மூலம் செல் உயிர்வாழ்திறன் மதிப்பிடப்பட்டது. 570 nm அலைநீளத்தில், பல்முறை நுண்தட்டு வாசிப்பானில் (மித்ராஸ் LB940) ஒளி அடர்த்தி மதிப்புகள் பெறப்பட்டன.
இன் விட்ரோ ஆஞ்சியோஜெனீசிஸ் சோதனைகளைப் பயன்படுத்தி DEET-இன் விளைவுகள் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. 10⁻⁸ M அல்லது 10⁻⁵ M DEET கொண்டு சிகிச்சை அளித்தபோது, HUVEC-களில் நுண்குழாய் நீளம் உருவாவது அதிகரித்தது (படம் 1a, b, வெள்ளை பட்டைகள்). கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடுகையில், 10⁻¹⁴ முதல் 10⁻⁵ M வரையிலான DEET செறிவுகளில் சிகிச்சை அளித்தபோது, நுண்குழாய் நீளம் 10⁻⁸ M DEET-இல் ஒரு சமநிலையை அடைந்தது (துணைப் படம் S2). 10⁻⁸ M மற்றும் 10⁻⁵ M செறிவு வரம்பில் DEET கொண்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட HUVEC-களின் இன் விட்ரோ புரோஆஞ்சியோஜெனிக் விளைவில் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு எதுவும் காணப்படவில்லை.
புதிய இரத்த நாளங்கள் உருவாவதில் DEET-இன் விளைவைத் தீர்மானிக்க, நாங்கள் உயிருள்ள உயிரினங்களில் புதிய இரத்த நாளங்கள் உருவாதல் ஆய்வுகளை மேற்கொண்டோம். 14 நாட்களுக்குப் பிறகு, 10⁻⁸ M அல்லது 10⁻⁵ M DEET உடன் முன் வளர்க்கப்பட்ட எண்டோதீலியல் செல்கள் செலுத்தப்பட்ட எலிகளில் ஹீமோகுளோபின் அளவு கணிசமாக அதிகரித்தது (படம் 1c, வெள்ளை பட்டைகள்).
மேலும், மனிதர்களில் சாதாரணமாகக் காணப்படும் 10⁻⁵ M பிளாஸ்மா செறிவுகளைத் தூண்டும் என்று அறியப்பட்ட அளவில், DEET-ஐ தினசரி (ip) ஊசி மூலம் செலுத்தப்பட்ட U87MG செனோகிராஃப்ட் தாங்கிய எலிகளில் DEET-ஆல் தூண்டப்பட்ட புதிய இரத்த நாள உருவாக்கம் ஆய்வு செய்யப்பட்டது. எலிகளில் U87MG செல்களை ஊசி மூலம் செலுத்திய 14 நாட்களுக்குப் பிறகு, கண்டறியக்கூடிய கட்டிகள் (அதாவது >100 மிமீ³ கட்டிகள்) காணப்பட்டன. 28-ஆம் நாளில், கட்டுப்பாட்டு எலிகளுடன் ஒப்பிடும்போது DEET-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட எலிகளில் கட்டி வளர்ச்சி குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்திருந்தது (படம் 1d, சதுரங்கள்). மேலும், கட்டிகளின் CD31 சாயமேற்றல், DEET நுண்குழாய் பரப்பளவை குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தது, ஆனால் நுண் இரத்த நாளங்களின் அடர்த்தியை அதிகரிக்கவில்லை என்பதைக் காட்டியது (படம் 1e–g).
DETA-தூண்டப்பட்ட பெருக்கத்தில் மஸ்காரினிக் ஏற்பிகளின் பங்கைத் தீர்மானிக்க, pFHHSiD (10-7 M, ஒரு தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட M3 ஏற்பி எதிர்ப்பி) முன்னிலையில் 10-8 M அல்லது 10-5 M DETA பயன்படுத்தப்பட்டது. HUVEC-க்கு சிகிச்சையளித்தபோது, pFHHSiD அனைத்து செறிவுகளிலும் DETA-வின் பெருக்கப் பண்புகளை முழுமையாகத் தடுத்தது (அட்டவணை 1).
இந்த நிலைமைகளின் கீழ், HUVEC செல்களில் DEET நுண்குழாய் நீளத்தை அதிகரிக்குமா என்பதையும் நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். அதேபோல், pFHHSiD ஆனது DEET-ஆல் தூண்டப்பட்ட நுண்குழாய் நீளத்தை குறிப்பிடத்தக்க அளவில் தடுத்தது (படம் 1a, b, சாம்பல் நிறப் பட்டைகள்). மேலும், M3 siRNA-ஐக் கொண்டும் இதேபோன்ற சோதனைகள் செய்யப்பட்டன. கட்டுப்பாட்டு siRNA நுண்குழாய் உருவாக்கத்தை ஊக்குவிப்பதில் திறம்பட செயல்படவில்லை என்றாலும், M3 மஸ்காரினிக் ஏற்பியை செயலிழக்கச் செய்வது, நுண்குழாய் நீளத்தை அதிகரிக்கும் DEET-இன் திறனை நீக்கியது (படம் 1a, b, கருப்புப் பட்டைகள்).
மேலும், இன் விட்ரோவில் 10-8 M அல்லது 10-5 M DEET-ஆல் தூண்டப்பட்ட இரத்த நாள உருவாக்கம் மற்றும் இன் விவோவில் புதிய இரத்த நாள உருவாக்கம் ஆகிய இரண்டும் pFHHSiD-ஆல் முழுமையாகத் தடுக்கப்பட்டன (படம் 1c, d, வட்டங்கள்). இந்த முடிவுகள், தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட M3 ஏற்பி எதிர்ப்பிகள் அல்லது M3 siRNA-க்கு உணர்திறன் கொண்ட ஒரு வழிமுறையின் மூலம் DEET இரத்த நாள உருவாக்கத்தை ஊக்குவிக்கிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன.
AChE என்பது DEET-இன் மூலக்கூறு இலக்காகும். AChE தடுப்பான்களாகச் செயல்படும் டோனெபெசில் போன்ற மருந்துகள், இன் விட்ரோவிலும் மற்றும் எலியின் பின்னங்கால் இரத்தக்குறைவு மாதிரிகளிலும் EC இரத்த நாள உருவாக்கத்தைத் தூண்ட முடியும்¹⁴. HUVEC-இல் AChE நொதி செயல்பாட்டின் மீது DEET-இன் இரண்டு செறிவுகளின் விளைவை நாங்கள் சோதித்தோம். கட்டுப்பாட்டு நிலைமைகளுடன் ஒப்பிடும்போது, DEET-இன் குறைந்த (10⁻⁸ M) மற்றும் அதிக (10⁻⁵ M) செறிவுகள் எண்டோதீலியல் AChE செயல்பாட்டைக் குறைத்தன (படம் 2).
DEET-இன் இரண்டு செறிவுகளும் (10-8 M மற்றும் 10-5 M) HUVEC-இல் அசிடைல்கோலினெஸ்டரேஸ் செயல்பாட்டைக் குறைத்தன. அசிடைல்கோலினெஸ்டரேஸ் தடுப்பான்களுக்கான கட்டுப்பாடாக BW284c51 (10-5 M) பயன்படுத்தப்பட்டது. வாகனத்தால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, DEET-இன் இரண்டு செறிவுகளால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட HUVEC-இல் உள்ள AChE செயல்பாட்டின் சதவீதமாக முடிவுகள் வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன. மதிப்புகள் ஆறு தனிப்பட்ட சோதனைகளின் சராசரி ± SEM ஆக வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன. *p < 0.05 கட்டுப்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது (க்ருஸ்கல்-வாலிஸ் மற்றும் டன் பல ஒப்பீட்டு சோதனை).
நைட்ரிக் ஆக்சைடு (NO) ஆஞ்சியோஜெனிக் செயல்பாட்டில் ஈடுபட்டுள்ளது³³, எனவே, DEET-ஆல் தூண்டப்பட்ட HUVEC-களில் NO உற்பத்தி ஆய்வு செய்யப்பட்டது. கட்டுப்பாட்டு செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, DEET-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட எண்டோதீலியல் NO உற்பத்தி அதிகரித்தது, ஆனால் 10⁻⁸ M என்ற அளவில் மட்டுமே குறிப்பிடத்தக்கதாக இருந்தது (படம் 3c). DEET-தூண்டப்பட்ட NO உற்பத்தியைக் கட்டுப்படுத்தும் மூலக்கூறு மாற்றங்களைத் தீர்மானிக்க, eNOS வெளிப்பாடு மற்றும் செயல்படுத்தல் வெஸ்டர்ன் பிளாட்டிங் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. DEET சிகிச்சையானது eNOS வெளிப்பாட்டை மாற்றவில்லை என்றாலும், சிகிச்சையளிக்கப்படாத செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, eNOS பாஸ்போரைலேஷனில் அதன் செயல்படுத்தும் தளத்தில் (Ser-1177) eNOS பாஸ்போரைலேஷனை கணிசமாக அதிகரித்தது, அதே நேரத்தில் அதன் தடுப்பு தளத்தை (Thr-495) குறைத்தது (படம் 3d). மேலும், பாஸ்போரைலேட் செய்யப்பட்ட eNOS-இன் அளவை மொத்த நொதியின் அளவிற்கு இயல்பாக்கிய பிறகு, செயல்படுத்தும் தளம் மற்றும் தடுப்பு தளத்தில் உள்ள பாஸ்போரைலேட் செய்யப்பட்ட eNOS-இன் விகிதம் கணக்கிடப்பட்டது. சிகிச்சையளிக்கப்படாத செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது, DEET-இன் ஒவ்வொரு செறிவிலும் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட HUVEC-களில் இந்த விகிதம் கணிசமாக அதிகரித்தது (படம் 3d).
இறுதியாக, முக்கிய இரத்த நாள உருவாக்கக் காரணிகளில் ஒன்றான VEGF-இன் வெளிப்பாடு, வெஸ்டர்ன் பிளாட்டிங் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. DEET, VEGF வெளிப்பாட்டைக் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தது, அதேசமயம் pFHHSiD இந்த வெளிப்பாட்டை முழுமையாகத் தடுத்தது.
DEET-இன் விளைவுகள் மருந்தியல் தடுப்பு மற்றும் M3 ஏற்பிகளின் செயல்பாட்டைக் குறைத்தல் ஆகிய இரண்டிற்கும் உணர்திறன் கொண்டிருப்பதால், DEET கால்சியம் சமிக்ஞையை மேம்படுத்தக்கூடும் என்ற கருதுகோளை நாங்கள் சோதித்தோம். ஆச்சரியப்படும் விதமாக, பயன்படுத்தப்பட்ட இரண்டு செறிவுகளிலும், HUVEC (தரவு காட்டப்படவில்லை) மற்றும் HEK/M3 (படம் 4a, b) ஆகியவற்றில் சைட்டோபிளாஸ்மிக் கால்சியத்தை DEET அதிகரிக்கத் தவறியது.
பதிவிட்ட நேரம்: டிசம்பர் 30, 2024
