தண்டு நுனி மெரிஸ்டெமில் கணுவிடை உருவாக்கத்தில் கிபெரெல்லின்களின் பங்கை அளவுசார் கிபெரெல்லின் உயிர் உணரி வெளிப்படுத்துகிறது.

தண்டு நுனி மெரிஸ்டெம் (SAM) வளர்ச்சி, தண்டு அமைப்பிற்கு இன்றியமையாதது. தாவர ஹார்மோன்கள்கிபெரெலின்கள்தாவர வளர்ச்சியை ஒருங்கிணைப்பதில் ஜிஏ-க்கள் (GAs) முக்கியப் பங்கு வகிக்கின்றன, ஆனால் எஸ்ஏஎம்-இல் (SAM) அவற்றின் பங்கு இன்னும் முழுமையாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. இங்கே, ஜிஏ-வை அடையாளம் கண்டவுடன் அதன் சிதைவைப் பாதுகாக்கும் அதே வேளையில், ஜிஏ படியெடுத்தல் பதிலில் அதன் அத்தியாவசிய ஒழுங்குமுறைச் செயல்பாட்டை அடக்குவதற்காக டெல்லா (DELLA) புரதத்தை மரபணு மாற்றம் செய்வதன் மூலம், ஜிஏ சமிக்ஞைக்கான ஒரு விகித அளவீட்டு உயிரி உணரியை நாங்கள் உருவாக்கினோம். இந்த சிதைவு அடிப்படையிலான உயிரி உணரியானது, வளர்ச்சியின் போது ஜிஏ அளவுகளிலும் செல் உணர்தலிலும் ஏற்படும் மாற்றங்களைத் துல்லியமாகப் பதிவு செய்கிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். எஸ்ஏஎம்-இல் (SAM) ஜிஏ சமிக்ஞை செயல்பாட்டை வரைபடமாக்க இந்த உயிரி உணரியை நாங்கள் பயன்படுத்தினோம். அதிக ஜிஏ சமிக்ஞைகள், கணுவிடை செல்களின் முன்னோடிகளான உறுப்பு முதன்மைக்கருக்களுக்கு இடையில் அமைந்துள்ள செல்களில் பிரதானமாகக் காணப்படுகின்றன என்பதை நாங்கள் காட்டுகிறோம். செயல்பாட்டைப் பெறுதல் மற்றும் இழத்தல் அணுகுமுறைகளைப் பயன்படுத்தி, ஜிஏ ஆனது செல் பிரிவுத் தளத்தின் திசையமைப்பை ஒழுங்குபடுத்துகிறது, கணுவிடைகளின் வழக்கமான செல் அமைப்பை நிறுவுகிறது, அதன் மூலம் எஸ்ஏஎம்-இல் (SAM) கணுவிடை வரையறையை ஊக்குவிக்கிறது என்பதை நாங்கள் மேலும் நிரூபிக்கிறோம்.
தண்டின் நுனியில் அமைந்துள்ள தண்டு நுனி மெரிஸ்டம் (SAM), தண்டு செல்களின் ஒரு தனி இடத்தைக் கொண்டுள்ளது. இந்த செல்களின் செயல்பாடு, தாவரத்தின் வாழ்நாள் முழுவதும் ஒரு தொகுதிமுறையிலும் மீண்டும் மீண்டும் நிகழும் வகையிலும் பக்கவாட்டு உறுப்புகளையும் தண்டு கணுக்களையும் உருவாக்குகிறது. மீண்டும் மீண்டும் வரும் இந்த அலகுகள் ஒவ்வொன்றும், அல்லது தாவரக் கணுக்கள், கணுக்களில் கணுவிடைப் பகுதிகளையும் பக்கவாட்டு உறுப்புகளையும், மற்றும் இலைக்கோணங்களில் அச்சு மெரிஸ்டம்களையும் கொண்டுள்ளன¹. தாவரக் கணுக்களின் வளர்ச்சியும் அமைப்பும் வளர்ச்சியின் போது மாறுகின்றன. அரபிடாப்சிஸில், தாவர வளர்ச்சிப் பருவத்தில் கணுவிடைப் பகுதிகளின் வளர்ச்சி தடுக்கப்படுகிறது, மேலும் அச்சு மெரிஸ்டம்கள் ரோசெட் இலைகளின் கோணங்களில் செயலற்ற நிலையில் இருக்கின்றன. பூக்கும் பருவத்திற்கு மாறும் போது, ​​தண்டு நுனி மெரிஸ்டம் மஞ்சரி மெரிஸ்டமாக மாறி, நீளமான கணுவிடைப் பகுதிகள் மற்றும் கோண மொட்டுகளையும், தண்டு இலைகளின் கோணங்களில் சிறு கிளைகளையும், பின்னர், இலைகளற்ற பூக்களையும்² உருவாக்குகிறது. இலைகள், பூக்கள் மற்றும் கிளைகளின் உருவாக்கத்தைக் கட்டுப்படுத்தும் வழிமுறைகளைப் புரிந்துகொள்வதில் நாம் குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றம் அடைந்திருந்தாலும், கணுவிடைப் பகுதிகள் எவ்வாறு உருவாகின்றன என்பது பற்றி ஒப்பீட்டளவில் குறைவாகவே அறியப்பட்டுள்ளது.
ஜிஏ-க்களின் (GAs) இட-கால பரவலைப் புரிந்துகொள்வது, வெவ்வேறு திசுக்களிலும் வெவ்வேறு வளர்ச்சி நிலைகளிலும் இந்த ஹார்மோன்களின் செயல்பாடுகளை நன்கு புரிந்துகொள்ள உதவும். அதன் சொந்த ஊக்குவிப்பானின் செயல்பாட்டின் கீழ் வெளிப்படுத்தப்படும் RGA-GFP இணைவின் சிதைவைக் காட்சிப்படுத்துவது, வேர்களில் உள்ள மொத்த ஜிஏ அளவுகளின் ஒழுங்குமுறை குறித்த முக்கியமான தகவல்களை வழங்குகிறது¹⁵,¹⁶. இருப்பினும், RGA வெளிப்பாடு திசுக்களுக்கு இடையே வேறுபடுகிறது¹⁷ மற்றும் ஜிஏ-வால் ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது¹⁸. இதனால், RGA ஊக்குவிப்பானின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு, RGA-GFP உடன் காணப்படும் ஒளிரும் வடிவத்தை ஏற்படுத்தக்கூடும், எனவே இந்த முறை அளவுசார்ந்ததல்ல. மிக சமீபத்தில், உயிரியல் ரீதியாக செயல்படும் ஃபுளோரசெய்ன் (Fl)-குறியிடப்பட்ட ஜிஏ¹⁹,²⁰, வேர் அகப்புறணியில் ஜிஏ குவிவதையும், ஜிஏ போக்குவரத்தால் அதன் செல்லுலார் அளவுகள் ஒழுங்குபடுத்தப்படுவதையும் வெளிப்படுத்தியது. சமீபத்தில், ஜிஏ FRET உணரி nlsGPS¹, வேர்கள், இழைகள் மற்றும் இருளில் வளர்க்கப்பட்ட ஹைப்போகோட்டில்களில் ஜிஏ அளவுகள் செல் நீளத்துடன் தொடர்புடையவை என்பதைக் காட்டியது²¹. இருப்பினும், நாம் பார்த்தபடி, ஜிஏ செறிவு என்பது ஜிஏ சமிக்ஞை செயல்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்தும் ஒரே அளவுரு அல்ல, ஏனெனில் அது சிக்கலான உணர்தல் செயல்முறைகளைச் சார்ந்துள்ளது. இங்கு, டெல்லா (DELLA) மற்றும் ஜிஏ (GA) சமிக்ஞைப் பாதைகள் குறித்த நமது புரிதலின் அடிப்படையில், ஜிஏ சமிக்ஞைக்கான சிதைவு அடிப்படையிலான விகித அளவீட்டு உயிரி உணரியின் உருவாக்கம் மற்றும் பண்புக்கூறுகளை நாங்கள் விவரிக்கிறோம். இந்த அளவுசார் உயிரி உணரியை உருவாக்க, ஒரு ஒளிரும் புரதத்துடன் இணைக்கப்பட்டு திசுக்களில் பரவலாக வெளிப்படுத்தப்பட்ட, ஜிஏ-உணர்திறன் கொண்ட ஒரு பிறழ்வு RGA-வையும், அத்துடன் ஜிஏ-உணர்திறன் அற்ற ஒரு ஒளிரும் புரதத்தையும் நாங்கள் பயன்படுத்தினோம். பிறழ்வு RGA புரத இணைப்புகள் பரவலாக வெளிப்படுத்தப்படும்போது உள்ளார்ந்த ஜிஏ சமிக்ஞையில் குறுக்கிடுவதில்லை என்பதையும், இந்த உயிரி உணரியானது ஜிஏ உள்ளீடு மற்றும் உணரும் கருவியால் செய்யப்படும் ஜிஏ சமிக்ஞை செயலாக்கம் ஆகிய இரண்டிலிருந்தும் உருவாகும் சமிக்ஞை செயல்பாட்டை உயர் இட-காலத் தெளிவுத்திறனுடன் அளவிட முடியும் என்பதையும் நாங்கள் காட்டுகிறோம். ஜிஏ சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் இட-காலப் பரவலை வரைபடமாக்கவும், எஸ்ஏஎம் (SAM) மேல்தோலில் ஜிஏ எவ்வாறு செல் நடத்தையை ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதை அளவிடவும் இந்த உயிரி உணரியை நாங்கள் பயன்படுத்தினோம். உறுப்பு முதனிலைகளுக்கு இடையில் அமைந்துள்ள எஸ்ஏஎம் செல்களின் பிரிவுத் தளத்தின் திசையமைப்பை ஜிஏ ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதையும், அதன் மூலம் கணுவிடைப் பகுதியின் நியம செல் அமைப்பை வரையறுக்கிறது என்பதையும் நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம்.
இறுதியாக, வளரும் ஹைப்போகோட்டில்களைப் பயன்படுத்தி, உள்ளார்ந்த GA அளவுகளில் ஏற்படும் மாற்றங்களை qmRGA-ஆல் கண்டறிய முடியுமா என்று நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். நைட்ரேட், GA தொகுப்பை அதிகரிப்பதன் மூலமும், அதன் விளைவாக DELLA34 சிதைவை அதிகரிப்பதன் மூலமும் வளர்ச்சியைத் தூண்டுகிறது என்பதை நாங்கள் முன்னரே காட்டியிருந்தோம். அதன்படி, அதிக நைட்ரேட் வழங்கலின் கீழ் (10 mM NO3−) வளர்க்கப்பட்ட pUBQ10::qmRGA நாற்றுகளில் உள்ள ஹைப்போகோட்டிலின் நீளம், நைட்ரேட் பற்றாக்குறை நிலைகளில் வளர்க்கப்பட்ட நாற்றுகளில் உள்ளதை விட குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகமாக இருந்ததை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (துணைப் படம் 6a). இந்த வளர்ச்சிப் பிரதிபலிப்புக்கு இணங்க, நைட்ரேட் இல்லாத நிலையில் வளர்க்கப்பட்ட நாற்றுகளை விட, 10 mM NO3− நிலைகளில் வளர்க்கப்பட்ட நாற்றுகளின் ஹைப்போகோட்டில்களில் GA சமிக்ஞைகள் அதிகமாக இருந்தன (துணைப் படம் 6b, c). இவ்வாறு, GA செறிவில் ஏற்படும் உள்ளார்ந்த மாற்றங்களால் தூண்டப்படும் GA சமிக்ஞை மாற்றங்களைக் கண்காணிக்கவும் qmRGA உதவுகிறது.
சென்சார் வடிவமைப்பின் அடிப்படையில் எதிர்பார்க்கப்படுவது போல, qmRGA-ஆல் கண்டறியப்பட்ட GA சமிக்ஞை செயல்பாடு, GA செறிவு மற்றும் GA உணர்திறனைச் சார்ந்திருக்கிறதா என்பதைப் புரிந்துகொள்வதற்காக, தாவர வளர்ச்சி மற்றும் இனப்பெருக்கத் திசுக்களில் உள்ள மூன்று GID1 ஏற்பிகளின் வெளிப்பாட்டை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். நாற்றுகளில், GID1-GUS ரிப்போர்ட்டர் வரிசையானது, GID1a மற்றும் c ஆகியவை வித்திலைகளில் அதிக அளவில் வெளிப்படுத்தப்பட்டதைக் காட்டியது (படம் 3a–c). மேலும், மூன்று ஏற்பிகளும் இலைகள், பக்கவாட்டு வேர் முளைகள், வேர் நுனிகள் (GID1b-இன் வேர் மூடியைத் தவிர), மற்றும் வாஸ்குலர் அமைப்பு ஆகியவற்றில் வெளிப்படுத்தப்பட்டன (படம் 3a–c). மஞ்சரி SAM-இல், GID1b மற்றும் 1c-க்கு மட்டுமே GUS சமிக்ஞைகளை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (துணைப் படம் 7a–c). இன் சிட்டு ஹைப்ரிடைசேஷன் இந்த வெளிப்பாட்டு முறைகளை உறுதிப்படுத்தியதுடன், GID1c ஆனது SAM-இல் சீராகக் குறைந்த அளவில் வெளிப்படுத்தப்பட்டதையும், அதேசமயம் GID1b ஆனது SAM-இன் விளிம்பில் அதிக வெளிப்பாட்டைக் காட்டியதையும் மேலும் நிரூபித்தது (துணைப் படம் 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b மொழிபெயர்ப்பு இணைவு, SAM-இன் மையத்தில் குறைந்த அல்லது வெளிப்பாடு இல்லாததிலிருந்து உறுப்பு எல்லைகளில் அதிக வெளிப்பாடு வரை, GID1b வெளிப்பாட்டின் ஒரு தரப்படுத்தப்பட்ட வரம்பையும் வெளிப்படுத்தியது (துணைப் படம் 7m). இதனால், GID1 ஏற்பிகள் திசுக்கள் முழுவதும் மற்றும் உள்ளே சீராக விநியோகிக்கப்படவில்லை. அடுத்தடுத்த சோதனைகளில், GID1-இன் மிகை வெளிப்பாடு (pUBQ10::GID1a-mCherry), ஹைப்போகோட்டில்களில் வெளிப்புற GA பயன்பாட்டிற்கு qmRGA-இன் உணர்திறனை அதிகரித்ததையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் 3d, e). இதற்கு மாறாக, ஹைப்போகோட்டிலில் qd17mRGA மூலம் அளவிடப்பட்ட ஒளிர்தல், GA3 சிகிச்சைக்கு உணர்திறன் அற்றதாக இருந்தது (படம் 3f, g). இரண்டு சோதனைகளுக்கும், நாற்றுகளுக்கு அதிக செறிவுள்ள GA (100 μM GA3) மூலம் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது. இதன் மூலம் உணரியின் விரைவான நடத்தையை மதிப்பிட முடிந்தது, இதில் GID1 ஏற்பியுடன் பிணைக்கும் திறன் மேம்படுத்தப்பட்டது அல்லது இழக்கப்பட்டது. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் qmRGA பயோசென்சார் ஒரு GA மற்றும் GA சென்சாராக ஒருங்கிணைந்த செயல்பாட்டைக் கொண்டிருப்பதை உறுதிப்படுத்துவதோடு, GID1 ஏற்பியின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு சென்சாரின் உமிழ்வுத்திறனைக் கணிசமாக மாற்றியமைக்க முடியும் என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
இன்றுவரை, SAM-இல் GA சமிக்ஞைகளின் பரவல் தெளிவாக இல்லை. எனவே, GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் உயர்-தெளிவுத்திறன் கொண்ட அளவுசார் வரைபடங்களைக் கணக்கிட, நாங்கள் qmRGA-ஐ வெளிப்படுத்தும் தாவரங்களையும் pCLV3::mCherry-NLS தண்டு செல் ரிப்போர்ட்டர்35-ஐயும் பயன்படுத்தினோம். SAM வளர்ச்சியைக் கட்டுப்படுத்துவதில் L1 அடுக்கு36 ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிப்பதால், L1 அடுக்கில் (மேல்தோல்; படம் 4a, b, முறைகள் மற்றும் துணை முறைகளைப் பார்க்கவும்) கவனம் செலுத்தினோம். இங்கே, pCLV3::mCherry-NLS வெளிப்பாடு, GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் இட-கால பரவலைப் பகுப்பாய்வு செய்ய37 ஒரு நிலையான வடிவியல் குறிப்புப் புள்ளியை வழங்கியது. பக்கவாட்டு உறுப்பு வளர்ச்சிக்கு GA இன்றியமையாததாகக் கருதப்பட்டாலும்4, P3 நிலையில் இருந்து பூ மொட்டு (P) பகுதியில் GA சமிக்ஞைகள் குறைவாக இருந்ததை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் 4a, b). அதேசமயம், இளம் P1 மற்றும் P2 மொட்டுகள் மையப் பகுதியில் உள்ளதைப் போன்ற மிதமான செயல்பாட்டைக் கொண்டிருந்தன (படம் 4a, b). உறுப்பு முதன்மைக்கருக்களின் எல்லைகளில், P1/P2-இல் (எல்லையின் பக்கங்களில்) தொடங்கி P4-இல் உச்சத்தை அடைவதிலும், அத்துடன் முதன்மைக்கருக்களுக்கு இடையில் அமைந்துள்ள புறப்பகுதியின் அனைத்து செல்களிலும் உயர்வான GA சமிக்ஞை செயல்பாடு கண்டறியப்பட்டது (படம் 4a, b மற்றும் துணைப் படம் 8a, b). இந்த உயர்வான GA சமிக்ஞை செயல்பாடு புறத்தோலில் மட்டுமல்லாமல், L2 மற்றும் மேல் L3 அடுக்குகளிலும் காணப்பட்டது (துணைப் படம் 8b). qmRGA-வைப் பயன்படுத்தி SAM-இல் கண்டறியப்பட்ட GA சமிக்ஞைகளின் வடிவமும் காலப்போக்கில் மாறாமல் இருந்தது (துணைப் படம் 8c–f, k). நாங்கள் விரிவாக ஆய்வு செய்த ஐந்து தனித்தனி மரபுவழித் தாவரங்களின் T3 SAM-இல் qd17mRGA கட்டமைப்பு முறையாகக் குறைக்கப்பட்டிருந்தபோதிலும், pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP கட்டமைப்பைக் கொண்டு பெறப்பட்ட ஒளிர்தல் வடிவங்களை எங்களால் பகுப்பாய்வு செய்ய முடிந்தது (துணைப் படம் 8g–j, l). இந்தக் கட்டுப்பாட்டுக் கோட்டில், SAM-இல் ஒளிர்தல் விகிதத்தில் சிறிய மாற்றங்கள் மட்டுமே கண்டறியப்பட்டன, ஆனால் SAM மையத்தில் TagBFP உடன் தொடர்புடைய VENUS-இல் ஒரு தெளிவான மற்றும் எதிர்பாராத குறைவைக் கண்டோம். இது, qmRGA-ஆல் கவனிக்கப்பட்ட சமிக்ஞை முறை, mRGA-VENUS-இன் GA-சார்ந்த சிதைவைப் பிரதிபலிக்கிறது என்பதை உறுதிப்படுத்துகிறது, ஆனால் மெரிஸ்டம் மையத்தில் qmRGA, GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டை மிகைமதிப்பீடு செய்யக்கூடும் என்பதையும் இது நிரூபிக்கிறது. சுருக்கமாக, எங்கள் முடிவுகள், முதன்மையாக முதன்மை அரும்புகளின் பரவலைப் பிரதிபலிக்கும் ஒரு GA சமிக்ஞை முறையை வெளிப்படுத்துகின்றன. இந்த முதன்மை அரும்புகளுக்கு இடையேயான பகுதியின் (IPR) பரவலானது, வளரும் முதன்மை அரும்புக்கும் மையப் பகுதிக்கும் இடையில் உயர் GA சமிக்ஞை செயல்பாடு படிப்படியாக நிறுவப்படுவதால் ஏற்படுகிறது, அதே நேரத்தில் முதன்மை அரும்பில் GA சமிக்ஞை செயல்பாடு குறைகிறது (படம் 4c, d).
GID1b மற்றும் GID1c ஏற்பிகளின் பரவல் (மேலே காண்க), GA ஏற்பிகளின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு, SAM-இல் GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் வடிவத்தை வடிவமைக்க உதவுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது. GA-வின் வேறுபட்ட குவிப்பு இதில் சம்பந்தப்பட்டிருக்கக்கூடுமா என்று நாங்கள் யோசித்தோம். இந்த சாத்தியக்கூறை ஆராய, நாங்கள் nlsGPS1 GA FRET சென்சார்²¹-ஐப் பயன்படுத்தினோம். 100 நிமிடங்களுக்கு 10 μM GA⁴⁺⁷ கொண்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட nlsGPS1-இன் SAM-இல் அதிகரித்த செயல்பாட்டு அதிர்வெண் கண்டறியப்பட்டது (துணைப் படம் 9a–e). இது, nlsGPS1 வேர்களில்²¹ செயல்படுவது போலவே, SAM-இல் உள்ள GA செறிவில் ஏற்படும் மாற்றங்களுக்குப் பதிலளிக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. nlsGPS1 செயல்பாட்டு அதிர்வெண்ணின் இடஞ்சார்ந்த பரவல், SAM-இன் வெளிப்புற அடுக்குகளில் ஒப்பீட்டளவில் குறைந்த GA அளவுகளை வெளிப்படுத்தியது, ஆனால் அவை SAM-இன் மையத்திலும் எல்லைகளிலும் உயர்ந்திருந்தன என்பதைக் காட்டியது (படம் 4e மற்றும் துணைப் படம் 9a,c). இது, qmRGA வெளிப்படுத்திய இடஞ்சார்ந்த வடிவத்துடன் ஒப்பிடக்கூடிய ஒரு இடஞ்சார்ந்த வடிவத்தில் GA-வும் SAM-இல் பரவியுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது. ஒரு நிரப்பு அணுகுமுறையாக, நாங்கள் SAM-ஐ ஒளிரும் GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) அல்லது எதிர்மறை கட்டுப்பாடாக Fl மட்டும் கொண்டும் சிகிச்சை அளித்தோம். Fl சமிக்ஞை, குறைந்த தீவிரத்தில் இருந்தாலும், மையப் பகுதி மற்றும் ப்ரிமோர்டியம் உட்பட SAM முழுவதும் பரவியிருந்தது (படம் 4j மற்றும் துணைப் படம் 10d). இதற்கு மாறாக, மூன்று GA-Fl-களும் குறிப்பாக ப்ரிமோர்டியம் எல்லைகளுக்குள்ளும், IPR-இன் மற்ற பகுதிகளில் வெவ்வேறு அளவுகளிலும் குவிந்தன; GA7-Fl ஆனது IPR-இன் மிகப்பெரிய பகுதியில் குவிந்தது (படம் 4k மற்றும் துணைப் படம் 10a,b). ஒளிர்தல் தீவிரத்தின் அளவீடு, Fl-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட SAM உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​GA-Fl-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட SAM-இல் IPR-க்கும் IPR அல்லாத பகுதிக்கும் இடையிலான தீவிர விகிதம் அதிகமாக இருந்ததை வெளிப்படுத்தியது (படம் 4l மற்றும் துணைப் படம் 10c). ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள், உறுப்பு எல்லைக்கு மிக அருகில் அமைந்துள்ள IPR செல்களில் GA அதிக செறிவுகளில் உள்ளது என்று பரிந்துரைக்கின்றன. இது, SAM GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் வடிவமானது, GA ஏற்பிகளின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு மற்றும் உறுப்பு எல்லைகளுக்கு அருகிலுள்ள IPR செல்களில் GA-வின் வேறுபட்ட திரட்சி ஆகிய இரண்டின் விளைவாக ஏற்படுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது. இவ்வாறு, எங்கள் பகுப்பாய்வு, GA சமிக்ஞையின் எதிர்பாராத ஒரு இட-கால வடிவத்தை வெளிப்படுத்தியது; இதில் SAM-இன் மையம் மற்றும் தொடக்க நிலையில் செயல்பாடு குறைவாகவும், புறப் பகுதியில் உள்ள IPR-இல் செயல்பாடு அதிகமாகவும் இருந்தது.
SAM-இல் உள்ள வேறுபட்ட GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் பங்கைப் புரிந்துகொள்வதற்காக, SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-இன் நிகழ்நேர டைம்-லேப்ஸ் இமேஜிங்கைப் பயன்படுத்தி, GA சமிக்ஞை செயல்பாடு, செல் விரிவாக்கம் மற்றும் செல் பிரிவு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். வளர்ச்சி ஒழுங்குமுறையில் GA-வின் பங்கைக் கருத்தில் கொண்டு, செல் விரிவாக்க அளவுருக்களுடன் ஒரு நேர்மறையான தொடர்பு எதிர்பார்க்கப்பட்டது. எனவே, நாங்கள் முதலில் GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டு வரைபடங்களை, செல் மேற்பரப்பு வளர்ச்சி விகித வரைபடங்களுடனும் (ஒரு குறிப்பிட்ட செல் மற்றும் பிரிவின் போதுள்ள மகள் செல்களின் செல் விரிவாக்கத்தின் வலிமைக்கான ஒரு பதிலியாக) மற்றும் செல் விரிவாக்கத்தின் திசையை அளவிடும் வளர்ச்சி திசைச்சார்பு வரைபடங்களுடனும் ஒப்பிட்டோம் (இதுவும் ஒரு குறிப்பிட்ட செல் மற்றும் பிரிவின் போதுள்ள மகள் செல்களுக்கு இங்கே பயன்படுத்தப்பட்டது; படம் 5a,b, முறைகள் மற்றும் துணை முறைகளைப் பார்க்கவும்). எங்களின் SAM செல் மேற்பரப்பு வளர்ச்சி விகித வரைபடங்கள், எல்லையில் குறைந்தபட்ச வளர்ச்சி விகிதங்களையும், வளரும் மலர்களில் அதிகபட்ச வளர்ச்சி விகிதங்களையும் காட்டும் முந்தைய அவதானிப்புகளுடன்38,39 ஒத்துப்போகின்றன (படம் 5a). முதன்மைக் கூறு பகுப்பாய்வு (PCA), GA சமிக்ஞை செயல்பாடு செல் மேற்பரப்பு வளர்ச்சி தீவிரத்துடன் எதிர்மறையாகத் தொடர்புடையது என்பதைக் காட்டியது (படம் 5c). GA சமிக்ஞை உள்ளீடு மற்றும் வளர்ச்சித் தீவிரம் உள்ளிட்ட மாறுபாட்டின் முக்கிய அச்சுகள், அதிக CLV3 வெளிப்பாட்டால் தீர்மானிக்கப்பட்ட திசைக்கு செங்குத்தாக இருந்தன என்பதையும் நாங்கள் காட்டினோம். இது மீதமுள்ள பகுப்பாய்வுகளில் SAM மையத்திலிருந்து செல்கள் விலக்கப்பட்டதை உறுதிப்படுத்தியது. ஸ்பியர்மேன் தொடர்புப் பகுப்பாய்வு PCA முடிவுகளை உறுதிப்படுத்தியது (படம் 5d), IPR-இல் உள்ள அதிக GA சமிக்ஞைகள் அதிக செல் விரிவாக்கத்திற்கு வழிவகுக்கவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், தொடர்புப் பகுப்பாய்வு, GA சமிக்ஞை செயல்பாடு மற்றும் வளர்ச்சி திசைச்சார்பு ஆகியவற்றுக்கு இடையே ஒரு சிறிய நேர்மறைத் தொடர்பை வெளிப்படுத்தியது (படம் 5c, d). இது IPR-இல் உள்ள அதிக GA சமிக்ஞை, செல் வளர்ச்சியின் திசையையும், ஒருவேளை செல் பிரிவுத் தளத்தின் நிலையையும் பாதிக்கிறது என்று கூறுகிறது.
a, b ஏழு தனித்தனி தாவரங்களில் சராசரியாக எடுக்கப்பட்ட SAM-இன் சராசரி மேற்பரப்பு வளர்ச்சி (a) மற்றும் வளர்ச்சி திசைமாறாத்தன்மை (b) ஆகியவற்றின் வெப்ப வரைபடங்கள் (முறையே செல் விரிவாக்கத்தின் வலிமை மற்றும் திசைக்கான பதிலிகளாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன). c PCA பகுப்பாய்வில் பின்வரும் மாறிகள் அடங்கும்: GA சமிக்ஞை, மேற்பரப்பு வளர்ச்சி செறிவு, மேற்பரப்பு வளர்ச்சி திசைமாறாத்தன்மை மற்றும் CLV3 வெளிப்பாடு. PCA கூறு 1 முக்கியமாக மேற்பரப்பு வளர்ச்சி செறிவுடன் எதிர்மறையாகவும், GA சமிக்ஞையுடன் நேர்மறையாகவும் தொடர்பு கொண்டிருந்தது. PCA கூறு 2 முக்கியமாக மேற்பரப்பு வளர்ச்சி திசைமாறாத்தன்மையுடன் நேர்மறையாகவும், CLV3 வெளிப்பாட்டுடன் எதிர்மறையாகவும் தொடர்பு கொண்டிருந்தது. சதவீதங்கள் ஒவ்வொரு கூறினாலும் விளக்கப்படும் மாறுபாட்டைக் குறிக்கின்றன. d CZ-ஐத் தவிர்த்து, திசு அளவில் GA சமிக்ஞை, மேற்பரப்பு வளர்ச்சி செறிவு மற்றும் மேற்பரப்பு வளர்ச்சி திசைமாறாத்தன்மை ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான ஸ்பியர்மேன் தொடர்புப் பகுப்பாய்வு. வலதுபுறத்தில் உள்ள எண் இரண்டு மாறிகளுக்கு இடையேயான ஸ்பியர்மேன் ரோ மதிப்பாகும். நட்சத்திரக் குறிகள் தொடர்பு/எதிர்மறைத் தொடர்பு மிகவும் குறிப்பிடத்தக்கதாக இருக்கும் நிகழ்வுகளைக் குறிக்கின்றன. e கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி மூலம் Col-0 SAM L1 செல்களின் 3D காட்சிப்படுத்தல். 10 மணி நேரத்தில் SAM-இல் (ஆனால் முதன்மைக்கருவில் அல்ல) உருவான புதிய செல் சுவர்கள் அவற்றின் கோண மதிப்புகளுக்கு ஏற்ப வண்ணமிடப்பட்டுள்ளன. வண்ணப் பட்டை கீழ் வலது மூலையில் காட்டப்பட்டுள்ளது. உள்ளிணைப்புப் படம் 0 மணி நேரத்தில் எடுக்கப்பட்ட அதனுடன் தொடர்புடைய முப்பரிமாணப் படத்தைக் காட்டுகிறது. இந்தச் சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது, அதிலும் இதே போன்ற முடிவுகளே கிடைத்தன. பெட்டி வரைபடங்கள் IPR மற்றும் IPR அல்லாத Col-0 SAM-இல் உள்ள செல் பிரிவு விகிதங்களைக் காட்டுகின்றன (n = 10 தனித்த தாவரங்கள்). மையக் கோடு இடைநிலை மதிப்பையும், பெட்டியின் எல்லைகள் 25-வது மற்றும் 75-வது சதவிகித மதிப்புகளையும் காட்டுகின்றன. மீசைக்கோடுகள் R மென்பொருளைக் கொண்டு தீர்மானிக்கப்பட்ட குறைந்தபட்ச மற்றும் அதிகபட்ச மதிப்புகளைக் குறிக்கின்றன. P மதிப்புகள் வெல்ச்சின் இரு-முனை t-சோதனை மூலம் பெறப்பட்டன. g, h திட்ட வரைபடம்: (g) SAM-இன் மையத்திலிருந்து (வெள்ளை புள்ளிக் கோடு) ஆரத் திசையைப் பொறுத்து புதிய செல் சுவரின் (மெஜந்தா) கோணத்தை எவ்வாறு அளவிடுவது (குறுங்கோண மதிப்புகள், அதாவது 0–90°, மட்டுமே கணக்கில் எடுத்துக்கொள்ளப்படுகின்றன), மற்றும் (h) மெரிஸ்டத்திற்குள் உள்ள சுற்றளவு/பக்கவாட்டு மற்றும் ஆரத் திசைகளைக் காட்டுகிறது. i முறையே SAM (அடர் நீலம்), IPR (நடுத்தர நீலம்), மற்றும் IPR அல்லாத பகுதி (வெளிர் நீலம்) ஆகியவற்றின் குறுக்கே செல் பிரிவு தள நோக்குநிலையின் அதிர்வெண் வரைபடங்கள். P மதிப்புகள் இரு-முனை கோல்மோகோரோவ்-ஸ்மிர்னோவ் சோதனை மூலம் பெறப்பட்டன. இந்தச் சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது, ஒத்த முடிவுகளே கிடைத்தன. j முறையே P3 (வெளிர் பச்சை), P4 (நடுத்தர பச்சை), மற்றும் P5 (அடர் பச்சை) ஆகியவற்றைச் சுற்றியுள்ள IPR-இன் செல் பிரிவு தள நோக்குநிலையின் அதிர்வெண் வரைபடங்கள். P மதிப்புகள் இரு-முனை கோல்மோகோரோவ்-ஸ்மிர்னோவ் சோதனை மூலம் பெறப்பட்டன. இந்தச் சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது, ஒத்த முடிவுகளே கிடைத்தன.
எனவே, அடுத்ததாக, ஆய்வின் போது புதிதாக உருவான செல் சுவர்களை அடையாளம் காண்பதன் மூலம், GA சமிக்ஞைக்கும் செல் பிரிவு செயல்பாட்டிற்கும் இடையிலான தொடர்பை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம் (படம் 5e). இந்த அணுகுமுறை, செல் பிரிவின் அதிர்வெண்ணையும் திசையையும் அளவிட எங்களுக்கு உதவியது. ஆச்சரியப்படும் விதமாக, IPR மற்றும் SAM-இன் மற்ற பகுதிகளில் (IPR அல்லாதவை, படம் 5f) செல் பிரிவுகளின் அதிர்வெண் ஒரே மாதிரியாக இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். இது, IPR மற்றும் IPR அல்லாத செல்களுக்கு இடையிலான GA சமிக்ஞையில் உள்ள வேறுபாடுகள் செல் பிரிவை குறிப்பிடத்தக்க அளவில் பாதிக்கவில்லை என்பதைக் காட்டுகிறது. இதுவும், GA சமிக்ஞைக்கும் வளர்ச்சி திசைச்சார்புக்கும் இடையிலான நேர்மறையான தொடர்பும், GA சமிக்ஞை செயல்பாடு செல் பிரிவு தளத்தின் திசையமைப்பை பாதிக்க முடியுமா என்று கருத்தில் கொள்ள எங்களைத் தூண்டியது. மெரிஸ்டம் மையத்தையும் புதிய செல் சுவரின் மையத்தையும் இணைக்கும் ஆர அச்சைப் பொறுத்து, புதிய செல் சுவரின் திசையமைப்பை ஒரு குறுங்கோணமாக நாங்கள் அளவிட்டோம் (படம் 5e-i). மேலும், ஆர அச்சைப் பொறுத்து செல்கள் ஏறக்குறைய 90° கோணங்களில் பிரிவதற்கான ஒரு தெளிவான போக்கைக் கண்டறிந்தோம். இதில், 70–80° (23.28%) மற்றும் 80–90° (22.62%) கோணங்களில் மிக உயர்ந்த நிகழ்வெண்கள் காணப்பட்டன (படம் 5e,i). இது, சுற்றளவு/குறுக்கு திசையில் நிகழும் செல் பிரிவுகளுக்கு ஒத்திருந்தது (படம் 5h). இந்த செல் பிரிவு நடத்தையில் GA சமிக்ஞையின் பங்களிப்பை ஆராய்வதற்காக, IPR மற்றும் IPR அல்லாத பகுதிகளில் செல் பிரிவு அளவுருக்களைத் தனித்தனியாகப் பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம் 5i). IPR செல்களில் உள்ள பிரிவு கோணப் பரவல், IPR அல்லாத செல்கள் அல்லது முழு SAM-இல் உள்ள செல்களில் இருந்து வேறுபட்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம். IPR செல்கள் அதிக விகிதத்தில் பக்கவாட்டு/வட்ட வடிவ செல் பிரிவுகளைக் காட்டின, அதாவது 70–80° மற்றும் 80–90° (முறையே 33.86% மற்றும் 30.71%, தொடர்புடைய விகிதங்கள்) (படம் 5i). இவ்வாறு, GA சமிக்ஞை செயல்பாடு மற்றும் வளர்ச்சி திசைமாறாத்தன்மைக்கு இடையேயான தொடர்பைப் போலவே (படம் 5c, d), அதிக GA சமிக்ஞைக்கும் சுற்றளவு திசைக்கு நெருக்கமான செல் பிரிவு தள நோக்குநிலைக்கும் இடையே ஒரு தொடர்பு இருப்பதை எங்கள் அவதானிப்புகள் வெளிப்படுத்தின. இந்தத் தொடர்பின் இடஞ்சார்ந்த பாதுகாப்பை மேலும் உறுதிப்படுத்த, P3-இல் இருந்து தொடங்கும் முதன்மை உறுப்பைச் சுற்றியுள்ள IPR செல்களில் பிரிவு தள நோக்குநிலையை நாங்கள் அளந்தோம், ஏனெனில் P4-இல் இருந்து தொடங்கும் இந்தப் பகுதியில்தான் மிக உயர்ந்த GA சமிக்ஞை செயல்பாடு கண்டறியப்பட்டது (படம் 4). P3 மற்றும் P4-ஐச் சுற்றியுள்ள IPR-இன் பிரிவு கோணங்களில் புள்ளிவிவரப்படி குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகள் எதுவும் காணப்படவில்லை, இருப்பினும் P4-ஐச் சுற்றியுள்ள IPR-இல் பக்கவாட்டு செல் பிரிவுகளின் அதிகரித்த அதிர்வெண் காணப்பட்டது (படம் 5j). இருப்பினும், P5-ஐச் சுற்றியுள்ள IPR செல்களில், செல் பிரிவுத் தளத்தின் திசையமைப்பில் உள்ள வேறுபாடு புள்ளிவிவரப்படி குறிப்பிடத்தக்கதாக மாறியது, மேலும் குறுக்கு செல் பிரிவுகளின் அதிர்வெண்ணில் ஒரு கூர்மையான அதிகரிப்பு காணப்பட்டது (படம் 5j). ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள், GA சமிக்ஞையானது SAM-இல் செல் பிரிவுகளின் திசையமைப்பைக் கட்டுப்படுத்த முடியும் என்று பரிந்துரைக்கின்றன. இது, உயர் GA சமிக்ஞையானது IPR-இல் செல் பிரிவுகளின் பக்கவாட்டு திசையமைப்பைத் தூண்ட முடியும் என்ற முந்தைய அறிக்கைகளுடன்40,41 ஒத்துப்போகிறது.
IPR-இல் உள்ள செல்கள் முதன்மைக்கருக்களில் இணைக்கப்படாமல், மாறாக கணுவிடைப் பகுதிகளில் இணைக்கப்படும் என்று கணிக்கப்பட்டுள்ளது²⁴²,⁴³. IPR-இல் செல் பிரிவுகளின் குறுக்கு திசையமைப்பானது, கணுவிடைப் பகுதிகளில் புறத்தோல் செல்களின் இணையான நீள்வரிசைகளின் வழக்கமான அமைப்புக்கு வழிவகுக்கலாம். மேலே விவரிக்கப்பட்ட நமது அவதானிப்புகள், செல் பிரிவின் திசையை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம், இந்தச் செயல்பாட்டில் GA சமிக்ஞை ஒரு பங்கைக் கொண்டிருக்கக்கூடும் என்று சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
பல டெல்லா மரபணுக்களின் செயல்பாடின்மை ஒரு தொடர்ச்சியான GA மறுமொழிக்கு வழிவகுக்கிறது, மேலும் இந்தக் கருதுகோளைச் சோதிக்க டெல்லா சடுதிமாற்றிகளைப் பயன்படுத்தலாம்44. நாங்கள் முதலில் SAM-இல் ஐந்து டெல்லா மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டு வடிவங்களைப் பகுப்பாய்வு செய்தோம். GUS வரிசையின்45 படியெடுத்தல் இணைவு, GAI, RGA, RGL1 மற்றும் RGL2 (மிகக் குறைந்த அளவில்) ஆகியவை SAM-இல் வெளிப்படுத்தப்பட்டதை வெளிப்படுத்தியது (துணைப் படம் 11a–d). இன் சிட்டு கலப்பினமாக்கல், GAI mRNA குறிப்பாக முதன்மை மொட்டுகளிலும் வளரும் மலர்களிலும் குவிகிறது என்பதை மேலும் நிரூபித்தது (துணைப் படம் 11e). RGL1 மற்றும் RGL3 mRNA ஆகியவை SAM விதானம் முழுவதும் மற்றும் முதிர்ந்த மலர்களிலும் கண்டறியப்பட்டன, அதேசமயம் RGL2 mRNA எல்லைப் பகுதியில் அதிகமாகக் காணப்பட்டது (துணைப் படம் 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-இன் கான்ஃபோகல் படமெடுத்தல், இன் சிட்டு கலப்பினமாக்கல் மூலம் காணப்பட்ட வெளிப்பாட்டை உறுதிப்படுத்தியது மற்றும் RGL3 புரதம் SAM-இன் மையப் பகுதியில் குவிகிறது என்பதைக் காட்டியது (துணைப் படம் 11i). pRGA::GFP-RGA வரிசையைப் பயன்படுத்தி, RGA புரதம் SAM-இல் குவிகிறது என்பதையும், ஆனால் P4-இலிருந்து தொடங்கி எல்லையில் அதன் செறிவு குறைகிறது என்பதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (துணைப் படம் 11j). குறிப்பிடத்தக்க வகையில், qmRGA-ஆல் கண்டறியப்பட்டபடி (படம் 4), RGL3 மற்றும் RGA-வின் வெளிப்பாட்டு வடிவங்கள் IPR-இல் உள்ள உயர் GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டுடன் ஒத்துப்போகின்றன. மேலும், இந்தத் தரவுகள் அனைத்து DELLA-க்களும் SAM-இல் வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதையும், அவற்றின் வெளிப்பாடு ஒட்டுமொத்தமாக முழு SAM-ஐயும் உள்ளடக்கியுள்ளது என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
அடுத்து, இயல்புவகை SAM (Ler, கட்டுப்பாடு) மற்றும் gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 டெல்லா குவின்டபிள் (குளோபல்) சடுதிமாற்றிகளில் உள்ள செல் பிரிவு அளவுருக்களை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம் 6a, b). சுவாரஸ்யமாக, இயல்புவகையுடன் ஒப்பிடும்போது டெல்லா குளோபல் சடுதிமாற்றி SAM-இல் செல் பிரிவு கோண அதிர்வெண்களின் பரவலில் புள்ளிவிவரப்படி குறிப்பிடத்தக்க மாற்றத்தை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் 6c). டெல்லா குளோபல் சடுதிமாற்றியில் ஏற்பட்ட இந்த மாற்றம், 80–90° கோணங்களின் அதிர்வெண் (34.71% எதிராக 24.55%) மற்றும், குறைந்த அளவில், 70–80° கோணங்களின் அதிர்வெண் (23.78% எதிராக 20.18%) அதிகரித்ததன் காரணமாக இருந்தது, அதாவது, இவை குறுக்கு செல் பிரிவுகளுக்கு ஒத்தவை (படம் 6c). குறுக்கு அல்லாத பிரிவுகளின் (0–60°) அதிர்வெண்ணும் டெல்லா குளோபல் சடுதிமாற்றியில் குறைவாக இருந்தது (படம் 6c). டெல்லா குளோபல் மரபணு மாற்றியின் SAM-இல் குறுக்கு செல் பிரிவுகளின் அதிர்வெண் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தது (படம் 6b). இயல்பு வகையுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​டெல்லா குளோபல் மரபணு மாற்றியில் IPR-இலும் குறுக்கு செல் பிரிவுகளின் அதிர்வெண் அதிகமாக இருந்தது (படம் 6d). IPR பகுதிக்கு வெளியே, இயல்பு வகையில் செல் பிரிவு கோணங்களின் பரவல் மிகவும் சீராக இருந்தது, ஆனால் டெல்லா குளோபல் மரபணு மாற்றி IPR-ஐப் போன்ற தொடுகோட்டுப் பிரிவுகளை விரும்பியது (படம் 6e). மேலும், GA-செயலற்ற மரபணு மாற்றிப் பின்னணியில் GA குவிவதால், ga2 ஆக்சிடேஸ் (ga2ox) ஐந்தடுக்கு மரபணு மாற்றிகளின் (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, மற்றும் ga2ox6-2) SAM-இல் செல் பிரிவுகளின் திசையமைப்பையும் நாங்கள் அளவிட்டோம். GA அளவுகளின் அதிகரிப்புக்கு ஏற்ப, ஐந்தடுக்கு ga2ox சடுதிமாற்ற மஞ்சரியின் SAM, Col-0-ஐ விடப் பெரியதாக இருந்தது (துணைப் படம் 12a, b). மேலும், Col-0 உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​ஐந்தடுக்கு ga2ox SAM, செல் பிரிவு கோணங்களின் முற்றிலும் மாறுபட்ட பரவலைக் காட்டியது. இதில் கோண நிகழ்வெண் 50° முதல் 90° வரை அதிகரித்து, அதாவது மீண்டும் தொடுகோட்டுப் பிரிவுகளுக்குச் சாதகமாக இருந்தது (துணைப் படம் 12a–c). இவ்வாறு, GA சமிக்ஞையின் தொடர்ச்சியான செயல்பாடு மற்றும் GA திரட்சி ஆகியவை IPR மற்றும் SAM-இன் மற்ற பகுதிகளில் பக்கவாட்டு செல் பிரிவுகளைத் தூண்டுகின்றன என்பதை நாங்கள் காட்டுகிறோம்.
கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி, PI-சாயம் பூசப்பட்ட லெர் (a) மற்றும் குளோபல் டெல்லா மரபணு மாற்றியின் (b) SAM-இன் L1 அடுக்கின் முப்பரிமாணக் காட்சிப்படுத்தல். 10 மணி நேரக் காலப்பகுதியில் SAM-இல் (ஆனால் முதன்மை உறுப்பில் அல்ல) உருவான புதிய செல் சுவர்கள், அவற்றின் கோண மதிப்புகளுக்கு ஏற்ப வண்ணமிடப்பட்டுக் காட்டப்பட்டுள்ளன. உள்ளிணைப்புப் படம் 0 மணி நேரத்தில் உள்ள SAM-ஐக் காட்டுகிறது. வண்ணப் பட்டை கீழ் வலது மூலையில் காட்டப்பட்டுள்ளது. (b)-இல் உள்ள அம்பு, குளோபல் டெல்லா மரபணு மாற்றியில் சீரமைக்கப்பட்ட செல் வரிசைகளின் ஒரு உதாரணத்தைக் காட்டுகிறது. இந்தச் சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது, அதே போன்ற முடிவுகளே கிடைத்தன. லெர் மற்றும் குளோபல் டெல்லாவிற்கு இடையே, முழு SAM (d), IPR (e), மற்றும் IPR அல்லாத (f) ஆகியவற்றில் உள்ள செல் பிரிவுத் தள நோக்குநிலைகளின் நிகழ்வெண் பரவலின் ஒப்பீடு. இரு-முனை கோல்மோகோரோவ்-ஸ்மிர்னோவ் சோதனையைப் பயன்படுத்தி P மதிப்புகள் பெறப்பட்டன. f, g Col-0 (i) மற்றும் pCUC2::gai-1-VENUS (j) மரபணு மாற்றப்பட்ட தாவரங்களின் PI-சாயம் பூசப்பட்ட SAM-இன் கான்ஃபோகல் படங்களின் முப்பரிமாணக் காட்சிப்படுத்தல். பேனல்கள் (a, b) 10 மணி நேரத்திற்குள் SAM-இல் உருவான புதிய செல் சுவர்களைக் (ஆனால் முதன்மை செல்களை அல்ல) காட்டுகின்றன. இந்தச் சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது, அதிலும் இதே போன்ற முடிவுகளே கிடைத்தன. h–j Col-0 மற்றும் pCUC2::gai-1-VENUS தாவரங்களுக்கு இடையே, முழு SAM (h), IPR (i) மற்றும் IPR அல்லாத (j) பகுதிகளில் அமைந்துள்ள செல் பிரிவு தள நோக்குநிலைகளின் நிகழ்வெண் பரவலின் ஒப்பீடு. P மதிப்புகள் இரு-முனை கோல்மோகோரோவ்-ஸ்மிர்னோவ் சோதனையைப் பயன்படுத்திப் பெறப்பட்டன.
அடுத்து, GA சமிக்ஞையைத் தடுப்பதன் விளைவை குறிப்பாக IPR-இல் சோதித்தோம். இதற்காக, VENUS உடன் இணைக்கப்பட்ட ஒரு மேலாதிக்க எதிர்மறை gai-1 புரதத்தின் வெளிப்பாட்டை இயக்க, நாங்கள் வித்திலை கோப்பை 2 (CUC2) ஊக்குவிப்பியைப் பயன்படுத்தினோம் (pCUC2::gai-1-VENUS வரிசையில்). இயல்புவகை SAM-இல், CUC2 ஊக்குவிப்பியானது P4 முதல், எல்லை செல்கள் உட்பட, SAM-இல் உள்ள பெரும்பாலான IPR-களின் வெளிப்பாட்டை இயக்குகிறது, மேலும் இதேபோன்ற குறிப்பிட்ட வெளிப்பாடு pCUC2::gai-1-VENUS தாவரங்களிலும் காணப்பட்டது (கீழே காண்க). pCUC2::gai-1-VENUS தாவரங்களின் SAM அல்லது IPR முழுவதும் உள்ள செல் பிரிவு கோணங்களின் பரவல் இயல்புவகையிலிருந்து குறிப்பிடத்தக்க அளவு வேறுபடவில்லை, இருப்பினும் எதிர்பாராதவிதமாக, இந்தத் தாவரங்களில் IPR இல்லாத செல்கள் 80–90° என்ற அதிக அதிர்வெண்ணில் பிரிந்ததைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 6f–j).
செல் பிரிவின் திசையானது, SAM-இன் வடிவவியலை, குறிப்பாக திசு வளைவினால் உருவாக்கப்படும் இழுவிசை அழுத்தத்தைச் சார்ந்துள்ளது என்று பரிந்துரைக்கப்பட்டுள்ளது46. எனவே, டெல்லா குளோபல் மரபணு மாற்றி மற்றும் pCUC2::gai-1-VENUS தாவரங்களில் SAM-இன் வடிவம் மாற்றப்பட்டதா என்று நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். முன்னர் அறிவிக்கப்பட்டபடி12, டெல்லா குளோபல் மரபணு மாற்றியின் SAM-இன் அளவு, இயல்பு வகையை விடப் பெரியதாக இருந்தது (துணைப் படம் 13a, b, d). CLV3 மற்றும் STM RNA-இன் இன் சிட்டு கலப்பினமாக்கல், டெல்லா மரபணு மாற்றிகளில் மெரிஸ்டம் விரிவாக்கத்தை உறுதிப்படுத்தியதுடன், தண்டு செல் இடத்தின் பக்கவாட்டு விரிவாக்கத்தையும் மேலும் காட்டியது (துணைப் படம் 13e, f, h, i). இருப்பினும், SAM வளைவு இரண்டு மரபணு வகைகளிலும் ஒரே மாதிரியாக இருந்தது (துணைப் படம் 13k, m, n, p). இயல்பு வகையுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 டெல்லா குவாட்ருபிள் மரபணு மாற்றியில் வளைவில் எந்த மாற்றமும் இல்லாமல், அளவில் இதேபோன்ற அதிகரிப்பை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (துணைப் படம் 13c, d, g, j, l, o, p). செல் பிரிவு திசையமைவின் அதிர்வெண்ணும் டெல்லா குவாட்ருபிள் மரபணு மாற்றியில் பாதிக்கப்பட்டது, ஆனால் டெல்லா மோனோலிதிக் மரபணு மாற்றியை விட குறைந்த அளவிலேயே பாதிக்கப்பட்டது (துணைப் படம் 12d–f). இந்த அளவு விளைவு, வளைவில் எந்த விளைவும் இல்லாததுடன் சேர்ந்து, டெல்லா குவாட்ருபிள் மரபணு மாற்றியில் உள்ள எஞ்சிய RGL3 செயல்பாடு, டெல்லா செயல்பாட்டின் இழப்பால் ஏற்படும் செல் பிரிவு திசையமைவு மாற்றங்களைக் கட்டுப்படுத்துகிறது என்பதையும், பக்கவாட்டு செல் பிரிவுகளில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் SAM வடிவவியலில் ஏற்படும் மாற்றங்களால் அல்லாமல், GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டில் ஏற்படும் மாற்றங்களுக்குப் பதிலளிக்கும் விதமாகவே நிகழ்கின்றன என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகிறது. மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி, CUC2 ஊக்குவிப்பான் P4-இல் தொடங்கி SAM-இல் IPR வெளிப்பாட்டை இயக்குகிறது (துணைப் படம் 14a, b), இதற்கு மாறாக, pCUC2::gai-1-VENUS SAM குறைக்கப்பட்ட அளவையும் ஆனால் அதிக வளைவையும் கொண்டிருந்தது (துணைப் படம் 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM உருவவியலில் ஏற்படும் இந்த மாற்றம், இயல்பு வகையுடன் ஒப்பிடும்போது இயந்திர அழுத்தங்களின் வேறுபட்ட பரவலுக்கு வழிவகுக்கலாம், இதில் அதிக சுற்றளவு அழுத்தங்கள் SAM மையத்திலிருந்து ஒரு குறுகிய தூரத்தில் தொடங்குகின்றன47. மாற்றாக, pCUC2::gai-1-VENUS SAM உருவவியலில் ஏற்படும் மாற்றங்கள், மரபணு வெளிப்பாட்டால் தூண்டப்பட்ட பிராந்திய இயந்திர பண்புகளில் ஏற்படும் மாற்றங்களின் விளைவாக இருக்கலாம்48. இரண்டு சந்தர்ப்பங்களிலும், செல்கள் சுற்றளவு/குறுக்கு நோக்குநிலையில் பிரிவதற்கான சாத்தியக்கூறை அதிகரிப்பதன் மூலம், இது GA சமிக்ஞையில் ஏற்படும் மாற்றங்களின் விளைவுகளை ஓரளவு ஈடுசெய்யக்கூடும், இது நமது அவதானிப்புகளை விளக்குகிறது.
ஒட்டுமொத்தமாக, IPR-இல் உள்ள செல் பிரிவுத் தளத்தின் பக்கவாட்டு நோக்குநிலையில் உயர் GA சமிக்ஞை ஒரு முக்கியப் பங்காற்றுகிறது என்பதை எங்கள் தரவுகள் உறுதிப்படுத்துகின்றன. மேலும், மெரிஸ்டம் வளைவும் IPR-இல் உள்ள செல் பிரிவுத் தளத்தின் நோக்குநிலையைப் பாதிக்கிறது என்பதையும் அவை காட்டுகின்றன.
அதிக GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் காரணமாக, IPR-இல் உள்ள பிரிவுத் தளத்தின் குறுக்கு நோக்குநிலையானது, பின்னர் புறத்தோல் கணுவிடைப் பகுதியில் காணப்படும் செல் அமைப்பை வரையறுப்பதற்காக, SAM-க்குள் உள்ள புறத்தோலில் GA ஒரு ஆர வடிவ செல் வரிசையை முன்கூட்டியே ஒழுங்கமைக்கிறது என்பதைக் காட்டுகிறது. உண்மையில், டெல்லா குளோபல் மரபணு மாற்றிகளின் SAM படங்களில் அத்தகைய செல் வரிசைகள் அடிக்கடி காணப்பட்டன (படம் 6b). எனவே, SAM-இல் GA சமிக்ஞையின் இடஞ்சார்ந்த வடிவத்தின் வளர்ச்சிச் செயல்பாட்டை மேலும் ஆராய்வதற்காக, இயல்புவகை (Ler மற்றும் Col-0), டெல்லா குளோபல் மரபணு மாற்றிகள் மற்றும் pCUC2::gai-1-VENUS மரபணு மாற்றப்பட்ட தாவரங்களில் உள்ள IPR-இல் செல்களின் இடஞ்சார்ந்த அமைப்பை பகுப்பாய்வு செய்ய, நாங்கள் டைம்-லேப்ஸ் இமேஜிங்கைப் பயன்படுத்தினோம்.
qmRGA பகுப்பாய்வின்படி, IPR-இல் GA சமிக்ஞை செயல்பாடு P1/P2-இலிருந்து அதிகரித்து P4-இல் உச்சத்தை அடைந்தது, மேலும் இந்த அமைப்பு காலப்போக்கில் மாறாமல் இருந்தது (படம் 4a–f மற்றும் துணைப் படம் 8c–f, k). அதிகரிக்கும் GA சமிக்ஞையுடன் IPR-இல் உள்ள செல்களின் இடஞ்சார்ந்த அமைப்பைப் பகுப்பாய்வு செய்ய, முதல் கண்காணிப்பிற்கு 34 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, அதாவது இரண்டு பிளாஸ்டிட் நேரங்களுக்கு மேல், பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட அவற்றின் வளர்ச்சிப் போக்கின்படி P4-க்கு மேலேயும் பக்கங்களிலும் உள்ள Ler IPR செல்களைக் குறியிட்டோம். இது, P1/P2-இலிருந்து P4 வரை முதன்மை வளர்ச்சிப் பருவத்தில் IPR செல்களைப் பின்தொடர எங்களுக்கு உதவியது. நாங்கள் மூன்று வெவ்வேறு வண்ணங்களைப் பயன்படுத்தினோம்: P4-க்கு அருகில் முதன்மையுடன் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட செல்களுக்கு மஞ்சள், IPR-இல் இருந்த செல்களுக்குப் பச்சை, மற்றும் இரண்டு செயல்முறைகளிலும் பங்கேற்ற செல்களுக்கு ஊதா (படம் 7a–c). t0 (0 மணி) நேரத்தில், P4-க்கு முன்னால் 1–2 அடுக்கு IPR செல்கள் காணப்பட்டன (படம் 7a). எதிர்பார்த்தபடியே, இந்தச் செல்கள் பிரிந்தபோது, ​​அவை முக்கியமாகக் குறுக்குப் பிரிவுத் தளத்தின் வழியாகவே பிரிந்தன (படம் 7a–c). Col-0 SAM-ஐப் பயன்படுத்தியும் இதே போன்ற முடிவுகள் பெறப்பட்டன (Ler-இல் P4-ஐப் போலவே அதன் எல்லை மடிந்திருப்பதால், P3-ஐ மையமாகக் கொண்டு பார்க்கும்போது), இருப்பினும் இந்த மரபணு வகையில், பூவின் எல்லையில் உருவான மடிப்பு IPR செல்களை மிக விரைவாக மறைத்தது (படம் 7g–i). இவ்வாறு, IPR செல்களின் பிரிவு முறையானது, கணுவிடைப் பகுதிகளைப் போலவே, செல்களை ஆர வரிசைகளாக முன்கூட்டியே ஒழுங்கமைக்கிறது. ஆர வரிசைகளின் ஒழுங்கமைப்பும், அடுத்தடுத்த உறுப்புகளுக்கு இடையில் IPR செல்கள் அமைந்திருப்பதும், இந்தச் செல்கள் கணுவிடை முன்னோடி செல்கள் என்பதை உணர்த்துகின்றன.
இங்கு, நாங்கள் qmRGA என்ற விகித அளவீட்டு GA சமிக்ஞை உயிரி உணரியை உருவாக்கினோம். இது, உள்ளார்ந்த சமிக்ஞைப் பாதைகளுடனான குறுக்கீட்டைக் குறைத்து, ஒருங்கிணைந்த GA மற்றும் GA ஏற்பிச் செறிவுகளிலிருந்து உருவாகும் GA சமிக்ஞைச் செயல்பாட்டின் அளவுசார் வரைபடத்தை அனுமதிக்கிறது. இதன் மூலம், செல்லுலார் மட்டத்தில் GA செயல்பாடு குறித்த தகவல்களை வழங்குகிறது. இந்த நோக்கத்திற்காக, நாங்கள் mRGA என்ற ஒரு மாற்றியமைக்கப்பட்ட டெல்லா புரதத்தை உருவாக்கினோம். இது டெல்லா இடைவினைப் பங்காளிகளுடன் பிணைக்கும் திறனை இழந்துள்ளது, ஆனால் GA-தூண்டப்பட்ட புரதச் சிதைவுக்கு உணர்திறன் கொண்டதாகவே உள்ளது. qmRGA, GA அளவுகளில் ஏற்படும் புற மற்றும் உள்ளார்ந்த மாற்றங்கள் இரண்டிற்கும் பதிலளிக்கிறது, மேலும் அதன் மாறும் உணர்திறன் பண்புகள், வளர்ச்சியின் போது GA சமிக்ஞைச் செயல்பாட்டில் ஏற்படும் இட-கால மாற்றங்களை மதிப்பிட உதவுகின்றன. qmRGA ஒரு மிகவும் நெகிழ்வான கருவியாகவும் உள்ளது, ஏனெனில் அதன் வெளிப்பாட்டிற்குப் பயன்படுத்தப்படும் ஊக்குவிப்பியை (தேவைப்பட்டால்) மாற்றுவதன் மூலம் வெவ்வேறு திசுக்களுக்கு ஏற்ப இதை மாற்றியமைக்க முடியும். மேலும், பூக்கும் தாவரங்கள் முழுவதும் GA சமிக்ஞைப் பாதை மற்றும் PFYRE உருவமைப்பின் பாதுகாக்கப்பட்ட தன்மையைக் கருத்தில் கொண்டு, இது மற்ற இனங்களுக்கும் மாற்றப்பட வாய்ப்புள்ளது²². இதற்கு இணங்க, நெல்லின் SLR1 டெல்லா புரதத்தில் உள்ள ஒரு சமமான சடுதிமாற்றம் (HYY497AAA), mRGA23-ஐப் போலவே, SLR1-இன் வளர்ச்சி அடக்கிச் செயல்பாட்டை அடக்குவதாகவும், அதே சமயம் அதன் GA-மத்தியஸ்த சிதைவைச் சிறிதளவு மட்டுமே குறைப்பதாகவும் காட்டப்பட்டது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், அரபிடாப்சிஸில் சமீபத்திய ஆய்வுகள், PFYRE டொமைனில் உள்ள ஒரு ஒற்றை அமினோ அமில சடுதிமாற்றம் (S474L), டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி கூட்டாளிகளுடன் தொடர்பு கொள்ளும் திறனைப் பாதிக்காமல், RGA-இன் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்பாட்டை மாற்றியமைத்தது என்பதைக் காட்டின50. இந்த சடுதிமாற்றம் mRGA-வில் உள்ள 3 அமினோ அமில பதிலீடுகளுக்கு மிகவும் நெருக்கமாக இருந்தாலும், இந்த இரண்டு சடுதிமாற்றங்களும் டெல்லாவின் தனித்துவமான பண்புகளை மாற்றுகின்றன என்பதை எங்கள் ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன. பெரும்பாலான டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி கூட்டாளிகள் டெல்லாவின் LHR1 மற்றும் SAW டொமைன்களுடன் பிணைந்தாலும்26,51, PFYRE டொமைனில் உள்ள சில பாதுகாக்கப்பட்ட அமினோ அமிலங்கள் இந்த தொடர்புகளை நிலைப்படுத்த உதவக்கூடும்.
தாவரக் கட்டமைப்பு மற்றும் மகசூல் மேம்பாட்டில் கணுவிடை வளர்ச்சி ஒரு முக்கியப் பண்பாகும். qmRGA, IPR கணுவிடை முன்னோடி செல்களில் அதிக GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்தியது. அளவுசார் படமாக்கல் மற்றும் மரபியலை இணைப்பதன் மூலம், GA சமிக்ஞை வடிவங்கள் SAM புறத்தோலில் வட்ட/குறுக்கு செல் பிரிவுத் தளங்களின் மீது மேற்பொருந்தி, கணுவிடை வளர்ச்சிக்குத் தேவையான செல் பிரிவு அமைப்பை வடிவமைக்கின்றன என்பதை நாங்கள் காட்டினோம். வளர்ச்சியின் போது செல் பிரிவுத் தள நோக்குநிலையின் பல ஒழுங்குபடுத்திகள் அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன52,53. GA சமிக்ஞை செயல்பாடு இந்த செல்லுலார் அளவுருவை எவ்வாறு ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதற்கு எங்கள் பணி ஒரு தெளிவான உதாரணத்தை வழங்குகிறது. DELLA, முன்மடிப்பு புரதக் கூட்டுகளுடன் தொடர்பு கொள்ள முடியும்41, எனவே GA சமிக்ஞை, புறணி நுண்குழாய் நோக்குநிலையை நேரடியாகப் பாதிப்பதன் மூலம் செல் பிரிவுத் தள நோக்குநிலையை ஒழுங்குபடுத்தக்கூடும்40,41,54,55. SAM-ல், அதிக GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் தொடர்பு செல் நீட்சி அல்லது பிரிவு அல்ல, மாறாக வளர்ச்சி திசைச்சார்பு மட்டுமே என்பதை நாங்கள் எதிர்பாராத விதமாகக் காட்டினோம், இது IPR-ல் செல் பிரிவின் திசையில் GA-வின் நேரடி விளைவுடன் ஒத்துப்போகிறது. இருப்பினும், இந்த விளைவு மறைமுகமாகவும் இருக்கலாம் என்பதை நாங்கள் நிராகரிக்க முடியாது, எடுத்துக்காட்டாக, GA-தூண்டப்பட்ட செல் சுவர் மென்மையாதல் மூலம் இது நிகழலாம்56. செல் சுவர் பண்புகளில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் இயந்திர அழுத்தத்தைத் தூண்டுகின்றன57,58, இது புறணி நுண்குழாய்களின் திசையமைப்பைப் பாதிப்பதன் மூலம் செல் பிரிவுத் தளத்தின் திசையமைப்பையும் பாதிக்கக்கூடும்39,46,59. GA-ஆல் தூண்டப்பட்ட இயந்திர அழுத்தம் மற்றும் GA-ஆல் நுண்குழாய் திசையமைப்பின் நேரடி ஒழுங்குமுறை ஆகியவற்றின் ஒருங்கிணைந்த விளைவுகள், கணுவிடைப் பகுதிகளை வரையறுக்க IPR-இல் ஒரு குறிப்பிட்ட செல் பிரிவு திசையமைப்பு வடிவத்தை உருவாக்குவதில் பங்கு வகிக்கக்கூடும், மேலும் இந்தக் கருத்தைச் சோதிக்க மேலதிக ஆய்வுகள் தேவைப்படுகின்றன. இதேபோல், முந்தைய ஆய்வுகள் கணுவிடைப் பகுதி உருவாக்கத்தைக் கட்டுப்படுத்துவதில் டெல்லாவுடன் இடைவினைபுரியும் புரதங்களான TCP14 மற்றும் 15-இன் முக்கியத்துவத்தை எடுத்துக்காட்டியுள்ளன60,61, மேலும் இந்தக் காரணிகள், கணுவிடைப் பகுதி வளர்ச்சியை ஒழுங்குபடுத்தி GA சமிக்ஞையைப் பாதிப்பதாகக் காட்டப்பட்டுள்ள பிரெவிபெடிசெல்லஸ் (BP) மற்றும் பென்னிவைஸ் (PNY) ஆகியவற்றுடன் இணைந்து GA-இன் செயல்பாட்டிற்கு மத்தியஸ்தம் செய்யக்கூடும்2,62. டெல்லாக்கள் பிராஸினோஸ்டீராய்டு, எத்திலீன், ஜாஸ்மோனிக் அமிலம் மற்றும் அப்சிசிக் அமிலம் (ABA) சமிக்ஞை வழித்தடங்களுடன்63,64 தொடர்பு கொள்கின்றன என்பதாலும், இந்த ஹார்மோன்கள் நுண்குழாய்களின் திசைவமைப்பைப் பாதிக்கக்கூடும்65 என்பதாலும், செல் பிரிவு திசைவமைப்பின் மீதான GA-வின் விளைவுகள் மற்ற ஹார்மோன்களாலும் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படலாம்.
ஆரம்பகால செல் ஆய்வுகள், அரபிடாப்சிஸ் SAM-இன் உள் மற்றும் வெளிப் பகுதிகள் இரண்டுமே கணுவிடை வளர்ச்சிக்குத் தேவைப்படுகின்றன என்பதைக் காட்டின²,⁴². உள் திசுக்களில் GA செல் பிரிவை தீவிரமாக ஒழுங்குபடுத்துகிறது¹² என்ற உண்மை, SAM-இல் மெரிஸ்டம் மற்றும் கணுவிடை அளவை ஒழுங்குபடுத்துவதில் GA-இன் இரட்டைச் செயல்பாட்டை ஆதரிக்கிறது. திசைசார் செல் பிரிவின் வடிவமும் உள் SAM திசுவில் இறுக்கமாக ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது, மேலும் இந்த ஒழுங்குமுறை தண்டு வளர்ச்சிக்கு இன்றியமையாதது⁵². உள் SAM அமைப்பில் செல் பிரிவுத் தளத்தை நோக்குவதிலும், அதன் மூலம் SAM-க்குள் கணுவிடைகளின் வரையறை மற்றும் வளர்ச்சியை ஒத்திசைப்பதிலும் GA ஒரு பங்கு வகிக்கிறதா என்பதை ஆராய்வது சுவாரஸ்யமாக இருக்கும்.
ஹைப்போகோட்டில் மற்றும் வேர் வளர்ச்சி சோதனைகளைத் தவிர, மற்ற அனைத்து சோதனைகளிலும் தாவரங்கள் மண்ணிலோ அல்லது 1% சுக்ரோஸ் மற்றும் 1% அகார் (சிக்மா) சேர்க்கப்பட்ட 1x முராஷிகே-ஸ்கூக் (MS) ஊடகத்திலோ (டுசெஃபா) நிலையான சூழ்நிலைகளில் (16 மணி நேர ஒளி, 22 °C) வளர்க்கப்பட்டன. ஹைப்போகோட்டில் மற்றும் வேர் வளர்ச்சி சோதனைகளில், நாற்றுகள் நிலையான ஒளி மற்றும் 22 °C வெப்பநிலையில் செங்குத்துத் தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்டன. நைட்ரேட் சோதனைகளுக்காக, தாவரங்கள் நீண்ட பகல் நேரச் சூழ்நிலைகளில், போதுமான நைட்ரேட் (0 அல்லது 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-சக்சினேட், 1% சுக்ரோஸ் மற்றும் 1% A-அகார் (சிக்மா) சேர்க்கப்பட்ட மாற்றியமைக்கப்பட்ட MS ஊடகத்தில் (பயோவேர்ல்ட் தாவர ஊடகம்) வளர்க்கப்பட்டன.
pDONR221-இல் செருகப்பட்ட GID1a cDNA, pDONR P4-P1R-pUBQ10 மற்றும் pDONR P2R-P3-mCherry ஆகியவற்றுடன் pB7m34GW-இல் மறுசேர்க்கை செய்யப்பட்டு pUBQ10::GID1a-mCherry உருவாக்கப்பட்டது. pDONR221-இல் செருகப்பட்ட IDD2 DNA, pB7RWG266-இல் மறுசேர்க்கை செய்யப்பட்டு p35S:IDD2-RFP உருவாக்கப்பட்டது. pGID1b::2xmTQ2-GID1b-ஐ உருவாக்குவதற்காக, GID1b குறியீட்டுப் பகுதிக்கு மேலே உள்ள 3.9 kb துண்டும், GID1b cDNA (1.3 kb) மற்றும் டெர்மினேட்டர் (3.4 kb) ஆகியவற்றைக் கொண்ட 4.7 kb துண்டும், துணை அட்டவணை 3-இல் உள்ள பிரைமர்களைப் பயன்படுத்தி முதலில் பெருக்கப்பட்டு, பின்னர் முறையே pDONR P4-P1R (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் pDONR P2R-P3 (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) ஆகியவற்றில் செருகப்பட்டு, இறுதியாக கேட்வே குளோனிங் முறையைப் பயன்படுத்தி pGreen 012567 இலக்கு வெக்டரில் pDONR221 2xmTQ268 உடன் மறுசேர்க்கை செய்யப்பட்டன. pCUC2::LSSmOrange-ஐ உருவாக்குவதற்காக, CUC2 ஊக்குவிப்பான் வரிசை (ATG-க்கு 3229 bp மேலே), அதைத் தொடர்ந்து N7 உட்கரு இடங்காணல் சமிக்ஞை மற்றும் NOS படியெடுத்தல் முடிப்பான் ஆகியவற்றைக் கொண்ட பெரிய ஸ்டோக்ஸ்-நகர்த்தப்பட்ட mOrange (LSSmOrange)69-இன் குறியீட்டு வரிசை ஆகியவை, கேட்வே 3-துண்டு மறுசேர்க்கை அமைப்பைப் (இன்விட்ரோஜென்) பயன்படுத்தி pGreen கனமைசின் இலக்கு திசையனில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டன. இந்த தாவர இரும திசையன், அக்ரோபாக்டீரியம் டுமெஃபேசியன்ஸ் GV3101 திரிபிலும், நிகோடியானா பெந்தாமியானா இலைகளிலும் அக்ரோபாக்டீரியம் ஊடுருவல் முறையிலும், மற்றும் அரபிடோப்சிஸ் தாலியானா Col-0-வில் மலர் நனைப்பு முறையிலும் முறையே அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry மற்றும் pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ஆகியவை அந்தந்தக் கலப்புகளின் F3 மற்றும் F1 சந்ததிகளிலிருந்து முறையே பிரித்தெடுக்கப்பட்டன.
சுமார் 1 செ.மீ நீளமுள்ள தளிர்களின் நுனிகளில் ஆர்.என்.ஏ இன் சிட்டு ஹைபிரிடைசேஷன் செய்யப்பட்டது72. அவை சேகரிக்கப்பட்டு, 4 °C-க்கு முன் குளிர்விக்கப்பட்ட FAA கரைசலில் (3.7% ஃபார்மால்டிஹைட், 5% அசிட்டிக் அமிலம், 50% எத்தனால்) உடனடியாக நிலைநிறுத்தப்பட்டன. 2 × 15 நிமிட வெற்றிட சிகிச்சைகளுக்குப் பிறகு, நிலைநிறுத்தி மாற்றப்பட்டு, மாதிரிகள் இரவு முழுவதும் அடைகாக்கப்பட்டன. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, மற்றும் RGL3 cDNA-க்களும், அவற்றின் 3′-UTR-களுக்கான ஆன்டிசென்ஸ் புரோப்களும், ரோசியர் மற்றும் குழுவினரால் விவரிக்கப்பட்டபடி73, துணை அட்டவணை 3-இல் காட்டப்பட்டுள்ள பிரைமர்களைப் பயன்படுத்தி தொகுக்கப்பட்டன. டிஜாக்சிஜெனின் ஆன்டிபாடிகளைப் (3000 மடங்கு நீர்த்தல்; ரோச், பட்டியல் எண்: 11 093 274 910) பயன்படுத்தி டிஜாக்சிஜெனின்-குறியிடப்பட்ட ஆய்வுக்கருவிகள் நோயெதிர்ப்பு முறையில் கண்டறியப்பட்டன, மேலும் பிரிவுகள் 5-ப்ரோமோ-4-குளோரோ-3-இண்டோலில் பாஸ்பேட் (BCIP, 250 மடங்கு நீர்த்தல்)/நைட்ரோப்ளூ டெட்ராசோலியம் (NBT, 200 மடங்கு நீர்த்தல்) கரைசலைக் கொண்டு சாயமிடப்பட்டன.