ஷூட் அபிகல் மெரிஸ்டெமில் இன்டர்னோட் விவரக்குறிப்பில் ஜிப்பெரெலின்களின் பங்கை அளவு சார்ந்த ஜிப்பெரெலின் பயோசென்சர் வெளிப்படுத்துகிறது.

தண்டு கட்டமைப்பிற்கு ஷூட் அபிகல் மெரிஸ்டெம் (SAM) வளர்ச்சி மிகவும் முக்கியமானது. தாவர ஹார்மோன்கள்கிப்பெரெலின்கள்(GAs) தாவர வளர்ச்சியை ஒருங்கிணைப்பதில் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன, ஆனால் SAM இல் அவற்றின் பங்கு இன்னும் சரியாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. இங்கே, GA டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் பதிலில் அதன் அத்தியாவசிய ஒழுங்குமுறை செயல்பாட்டை அடக்குவதற்கு DELLA புரதத்தை பொறியியல் செய்வதன் மூலம் GA சமிக்ஞையின் ரேஷியோமெட்ரிக் பயோசென்சரை உருவாக்கினோம், அதே நேரத்தில் GA அங்கீகாரத்தின் மீது அதன் சிதைவைப் பாதுகாக்கிறோம். இந்த சிதைவு அடிப்படையிலான பயோசென்சர் வளர்ச்சியின் போது GA அளவுகள் மற்றும் செல்லுலார் உணர்தலில் ஏற்படும் மாற்றங்களை துல்லியமாக பதிவு செய்கிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். SAM இல் GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டை வரைபடமாக்க இந்த பயோசென்சரைப் பயன்படுத்தினோம். அதிக GA சமிக்ஞைகள் முக்கியமாக உறுப்பு ப்ரிமார்டியாவிற்கு இடையில் அமைந்துள்ள செல்களில் உள்ளன என்பதைக் காட்டுகிறோம், அவை இன்டர்னோட் செல்களுக்கு முன்னோடிகளாகும். ஆதாயம் மற்றும் செயல்பாட்டு இழப்பு அணுகுமுறைகளைப் பயன்படுத்தி, GA செல் பிரிவு தளத்தின் நோக்குநிலையை ஒழுங்குபடுத்துகிறது, இன்டர்னோட்களின் நியமன செல்லுலார் அமைப்பை நிறுவுகிறது, இதன் மூலம் SAM இல் இன்டர்னோட் விவரக்குறிப்பை ஊக்குவிக்கிறது என்பதை நாங்கள் மேலும் நிரூபிக்கிறோம்.
தளிர் நுனியில் அமைந்துள்ள தளிர் நுனி மெரிஸ்டெம் (SAM), தாவரத்தின் வாழ்நாள் முழுவதும் பக்கவாட்டு உறுப்புகள் மற்றும் தண்டு முனைகளை உருவாக்கும் செயல்பாடு கொண்ட ஸ்டெம் செல்களின் ஒரு பகுதியைக் கொண்டுள்ளது. இந்த தொடர்ச்சியான அலகுகள் அல்லது தாவர முனைகள் ஒவ்வொன்றும், முனைகளில் உள்ள இடைக்கணுக்கள் மற்றும் பக்கவாட்டு உறுப்புகள் மற்றும் இலை அச்சுகளில் உள்ள அச்சு மெரிஸ்டெம்களை உள்ளடக்கியது. வளர்ச்சியின் போது தாவர முனைகளின் வளர்ச்சி மற்றும் அமைப்பு மாறுகிறது. அரபிடோப்சிஸில், தாவர கட்டத்தில் உள்கணு வளர்ச்சி அடக்கப்படுகிறது, மேலும் அச்சு மெரிஸ்டெம்கள் ரொசெட் இலைகளின் அச்சுகளில் செயலற்ற நிலையில் இருக்கும். மலர் கட்டத்திற்கு மாறும்போது, ​​SAM மஞ்சரி மெரிஸ்டெமாக மாறி, நீளமான இடைக்கணுக்கள் மற்றும் அச்சு மொட்டுகள், கோலைன் இலைகளின் அச்சுகளில் கிளைகள் மற்றும் பின்னர், இலையற்ற பூக்கள் 2 ஆகியவற்றை உருவாக்குகிறது. இலைகள், பூக்கள் மற்றும் கிளைகளின் துவக்கத்தைக் கட்டுப்படுத்தும் வழிமுறைகளைப் புரிந்துகொள்வதில் நாம் குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றம் அடைந்திருந்தாலும், இடைக்கணுக்கள் எவ்வாறு எழுகின்றன என்பது பற்றி ஒப்பீட்டளவில் குறைவாகவே அறியப்படுகிறது.
GA-களின் இடஞ்சார்ந்த-காலநிலை பரவலைப் புரிந்துகொள்வது, வெவ்வேறு திசுக்களிலும் வெவ்வேறு வளர்ச்சி நிலைகளிலும் இந்த ஹார்மோன்களின் செயல்பாடுகளை நன்கு புரிந்துகொள்ள உதவும். அதன் சொந்த ஊக்குவிப்பாளரின் செயல்பாட்டின் கீழ் வெளிப்படுத்தப்படும் RGA-GFP இணைவின் சிதைவைக் காட்சிப்படுத்துவது, வேர்களில் மொத்த GA அளவுகளை ஒழுங்குபடுத்துவது குறித்த முக்கியமான தகவல்களை வழங்குகிறது15,16. இருப்பினும், RGA வெளிப்பாடு திசுக்களில் வேறுபடுகிறது17 மற்றும் GA18 ஆல் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது. எனவே, RGA ஊக்குவிப்பாளரின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு RGA-GFP உடன் காணப்படும் ஒளிரும் வடிவத்திற்கு வழிவகுக்கும், எனவே இந்த முறை அளவு சார்ந்தது அல்ல. சமீபத்தில், பயோஆக்டிவ் ஃப்ளோரசெசின் (Fl)-லேபிளிடப்பட்ட GA19,20, வேர் எண்டோகார்டெக்ஸில் GA குவிவதையும் GA போக்குவரத்து மூலம் அதன் செல்லுலார் அளவுகளை ஒழுங்குபடுத்துவதையும் வெளிப்படுத்தியது. சமீபத்தில், GA FRET சென்சார் nlsGPS1, GA அளவுகள் வேர்கள், இழைகள் மற்றும் கருமையாக வளர்ந்த ஹைபோகோடைல்களில் செல் நீட்சியுடன் தொடர்புபடுத்துகின்றன என்பதைக் காட்டியது21. இருப்பினும், நாம் பார்த்தபடி, GA செறிவு GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்தும் ஒரே அளவுரு அல்ல, ஏனெனில் இது சிக்கலான உணர்திறன் செயல்முறைகளைப் பொறுத்தது. இங்கே, DELLA மற்றும் GA சமிக்ஞை பாதைகள் பற்றிய நமது புரிதலை அடிப்படையாகக் கொண்டு, GA சமிக்ஞைக்கான ஒரு சிதைவு அடிப்படையிலான ரேஷியோமெட்ரிக் பயோசென்சாரின் வளர்ச்சி மற்றும் தன்மையை நாங்கள் தெரிவிக்கிறோம். இந்த அளவு உயிரி உணரியை உருவாக்க, ஒரு ஒளிரும் புரதத்துடன் இணைக்கப்பட்டு திசுக்களில் எங்கும் வெளிப்படுத்தப்படும் ஒரு பிறழ்ந்த GA- உணர்திறன் கொண்ட RGA ஐயும், GA- உணர்வற்ற ஒளிரும் புரதத்தையும் பயன்படுத்தினோம். எங்கும் வெளிப்படுத்தப்படும்போது பிறழ்ந்த RGA புரத இணைப்புகள் எண்டோஜெனஸ் GA சமிக்ஞையில் தலையிடாது என்பதையும், இந்த உயிரி உணரி அதிக இடஞ்சார்ந்த தெளிவுத்திறனுடன் உணர்திறன் கருவியால் GA உள்ளீடு மற்றும் GA சமிக்ஞை செயலாக்கம் இரண்டின் விளைவாக ஏற்படும் சமிக்ஞை செயல்பாட்டை அளவிட முடியும் என்பதையும் நாங்கள் காட்டுகிறோம். GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் இடஞ்சார்ந்த விநியோகத்தை வரைபடமாக்குவதற்கும், SAM மேல்தோலில் GA செல்லுலார் நடத்தையை எவ்வாறு ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதை அளவிடுவதற்கும் இந்த உயிரி உணரியைப் பயன்படுத்தினோம். உறுப்பு முதன்மையானவற்றுக்கு இடையில் அமைந்துள்ள SAM செல்களின் பிரிவு தளத்தின் நோக்குநிலையை GA ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம், இதன் மூலம் இன்டர்னோடின் நியமன செல்லுலார் அமைப்பை வரையறுக்கிறோம்.
இறுதியாக, வளரும் ஹைபோகோடைல்களைப் பயன்படுத்தி எண்டோஜெனஸ் GA அளவுகளில் ஏற்படும் மாற்றங்களை qmRGA தெரிவிக்க முடியுமா என்று கேட்டோம். GA தொகுப்பை அதிகரிப்பதன் மூலமும், DELLA34 சிதைவை அதிகரிப்பதன் மூலமும் நைட்ரேட் வளர்ச்சியைத் தூண்டுகிறது என்பதை நாங்கள் முன்பு காட்டினோம். அதன்படி, ஏராளமான நைட்ரேட் விநியோகத்தின் கீழ் (10 mM NO3−) வளர்க்கப்படும் pUBQ10::qmRGA நாற்றுகளில் ஹைபோகோடைல் நீளம் நைட்ரேட் குறைபாடுள்ள நிலைமைகளின் கீழ் வளர்க்கப்படும் நாற்றுகளை விட கணிசமாக நீளமாக இருப்பதைக் கவனித்தோம் (துணை படம் 6a). வளர்ச்சி பதிலுக்கு இணங்க, நைட்ரேட் இல்லாத நிலையில் வளர்க்கப்படும் நாற்றுகளை விட 10 mM NO3− நிலைமைகளின் கீழ் வளர்க்கப்படும் நாற்றுகளின் ஹைபோகோடைல்களில் GA சமிக்ஞைகள் அதிகமாக இருந்தன (துணை படம் 6b, c). இதனால், qmRGA GA செறிவில் உள்ள எண்டோஜெனஸ் மாற்றங்களால் தூண்டப்படும் GA சமிக்ஞையில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் கண்காணிக்கவும் உதவுகிறது.
qmRGA ஆல் கண்டறியப்பட்ட GA சமிக்ஞை செயல்பாடு, சென்சார் வடிவமைப்பின் அடிப்படையில் எதிர்பார்க்கப்பட்டபடி, GA செறிவு மற்றும் GA உணர்வைப் பொறுத்தது என்பதைப் புரிந்து கொள்ள, தாவர மற்றும் இனப்பெருக்க திசுக்களில் உள்ள மூன்று GID1 ஏற்பிகளின் வெளிப்பாட்டை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். நாற்றுகளில், GID1a மற்றும் c ஆகியவை கோட்டிலிடன்களில் அதிகமாக வெளிப்படுத்தப்பட்டதாக GID1-GUS ரிப்போர்ட்டர் வரி காட்டியது (படம் 3a–c). கூடுதலாக, மூன்று ஏற்பிகளும் இலைகள், பக்கவாட்டு வேர் ப்ரிமார்டியா, வேர் நுனிகள் (GID1b இன் வேர் மூடியைத் தவிர) மற்றும் வாஸ்குலர் அமைப்பு (படம் 3a–c) ஆகியவற்றில் வெளிப்படுத்தப்பட்டன. மஞ்சரி SAM இல், GID1b மற்றும் 1c க்கு மட்டுமே GUS சமிக்ஞைகளைக் கண்டறிந்தோம் (துணை படம் 7a–c). இன் சிட்டு கலப்பினமாக்கல் இந்த வெளிப்பாடு வடிவங்களை உறுதிப்படுத்தியது மற்றும் GID1c SAM இல் குறைந்த மட்டங்களில் சீராக வெளிப்படுத்தப்பட்டது என்பதை மேலும் நிரூபித்தது, அதே நேரத்தில் GID1b SAM இன் சுற்றளவில் அதிக வெளிப்பாட்டைக் காட்டியது (துணை படம் 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b மொழிபெயர்ப்பு இணைவு, SAM இன் மையத்தில் குறைந்த அல்லது இல்லாத வெளிப்பாடு முதல் உறுப்பு எல்லைகளில் அதிக வெளிப்பாடு வரை GID1b வெளிப்பாட்டின் தரப்படுத்தப்பட்ட வரம்பையும் வெளிப்படுத்தியது (துணை படம் 7 மீ). இதனால், GID1 ஏற்பிகள் திசுக்களுக்குள்ளும் திசுக்களுக்குள்ளும் ஒரே மாதிரியாக விநியோகிக்கப்படவில்லை. அடுத்தடுத்த சோதனைகளில், GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) இன் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு ஹைபோகோடைல்களில் qmRGA இன் உணர்திறனை வெளிப்புற GA பயன்பாட்டிற்கு அதிகரித்ததையும் நாங்கள் கவனித்தோம் (படம் 3d, e). இதற்கு மாறாக, ஹைபோகோடைலில் qd17mRGA ஆல் அளவிடப்பட்ட ஃப்ளோரசன்சன் GA3 சிகிச்சைக்கு உணர்வற்றதாக இருந்தது (படம் 3f, g). இரண்டு மதிப்பீடுகளுக்கும், சென்சாரின் விரைவான நடத்தையை மதிப்பிடுவதற்கு நாற்றுகள் அதிக செறிவுள்ள GA (100 μM GA3) உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன, அங்கு GID1 ஏற்பியுடன் பிணைக்கும் திறன் மேம்படுத்தப்பட்டது அல்லது இழந்தது. ஒன்றாக, இந்த முடிவுகள் qmRGA பயோசென்சர் ஒரு GA மற்றும் GA சென்சாராக ஒருங்கிணைந்த செயல்பாட்டைச் செய்கிறது என்பதை உறுதிப்படுத்துகின்றன, மேலும் GID1 ஏற்பியின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு சென்சாரின் உமிழ்வை கணிசமாக மாற்றியமைக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
இன்றுவரை, SAM இல் GA சிக்னல்களின் பரவல் தெளிவாக இல்லை. எனவே, L1 அடுக்கை (மேல்தோல்; படம் 4a, b, முறைகள் மற்றும் துணை முறைகளைப் பார்க்கவும்) மையமாகக் கொண்டு, GA சிக்னலிங் செயல்பாட்டின் உயர் தெளிவுத்திறன் கொண்ட அளவு வரைபடங்களைக் கணக்கிட qmRGA-வெளிப்படுத்தும் தாவரங்கள் மற்றும் pCLV3::mCherry-NLS ஸ்டெம் செல் ரிப்போர்ட்டர்35 ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தினோம், ஏனெனில் L1 SAM வளர்ச்சியைக் கட்டுப்படுத்துவதில் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது36. இங்கே, pCLV3::mCherry-NLS வெளிப்பாடு GA சிக்னலிங் செயல்பாட்டின் இடஞ்சார்ந்த தற்காலிக விநியோகத்தை பகுப்பாய்வு செய்வதற்கான ஒரு நிலையான வடிவியல் குறிப்பு புள்ளியை வழங்கியது37. பக்கவாட்டு உறுப்பு வளர்ச்சிக்கு GA அவசியமாகக் கருதப்பட்டாலும்4, P3 நிலையிலிருந்து (படம் 4a, b) தொடங்கும் மலர் ப்ரிமார்டியத்தில் (P) GA சிக்னல்கள் குறைவாக இருப்பதைக் கண்டோம், அதே நேரத்தில் இளம் P1 மற்றும் P2 ப்ரிமார்டியங்கள் மத்திய பகுதியில் (படம் 4a, b) போலவே மிதமான செயல்பாட்டைக் கொண்டிருந்தன. உறுப்பு முதன்மை எல்லைகளில் அதிக GA சமிக்ஞை செயல்பாடு கண்டறியப்பட்டது, P1/P2 இல் (எல்லையின் பக்கங்களில்) தொடங்கி P4 இல் உச்சத்தை அடைந்தது, அதே போல் முதன்மைக்கு இடையில் அமைந்துள்ள புறப் பகுதியின் அனைத்து செல்களிலும் (படம் 4a, b மற்றும் துணை படம் 8a, b). இந்த உயர் GA சமிக்ஞை செயல்பாடு மேல்தோலில் மட்டுமல்ல, L2 மற்றும் மேல் L3 அடுக்குகளிலும் காணப்பட்டது (துணை படம் 8b). qmRGA ஐப் பயன்படுத்தி SAM இல் கண்டறியப்பட்ட GA சமிக்ஞைகளின் வடிவமும் காலப்போக்கில் மாறாமல் இருந்தது (துணை படம் 8c–f, k). qd17mRGA கட்டமைப்பு T3 தாவரங்களின் SAM இல் ஐந்து சுயாதீன கோடுகளிலிருந்து முறையாகக் குறைக்கப்பட்டிருந்தாலும், நாங்கள் விரிவாக வகைப்படுத்திய ஐந்து சுயாதீன கோடுகளிலிருந்து, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP கட்டமைப்பைப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்ட ஒளிரும் வடிவங்களை பகுப்பாய்வு செய்ய முடிந்தது (துணை படம் 8g–j, l). இந்தக் கட்டுப்பாட்டுக் கோட்டில், SAM இல் ஒளிரும் விகிதத்தில் சிறிய மாற்றங்கள் மட்டுமே கண்டறியப்பட்டன, ஆனால் SAM மையத்தில் TagBFP உடன் தொடர்புடைய VENUS இல் தெளிவான மற்றும் எதிர்பாராத குறைவைக் கண்டோம். qmRGA ஆல் கவனிக்கப்பட்ட சமிக்ஞை முறை mRGA-VENUS இன் GA-சார்ந்த சிதைவைப் பிரதிபலிக்கிறது என்பதை இது உறுதிப்படுத்துகிறது, ஆனால் qmRGA மெரிஸ்டெம் மையத்தில் GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டை மிகைப்படுத்தக்கூடும் என்பதையும் நிரூபிக்கிறது. சுருக்கமாக, எங்கள் முடிவுகள் முதன்மையாக ப்ரிமார்டியாவின் பரவலைப் பிரதிபலிக்கும் GA சமிக்ஞை முறையை வெளிப்படுத்துகின்றன. இடை-ப்ரிமார்டியல் பகுதியின் (IPR) இந்த விநியோகம், வளரும் ப்ரிமார்டியத்திற்கும் மத்தியப் பகுதிக்கும் இடையில் அதிக GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டை படிப்படியாக நிறுவுவதால் ஏற்படுகிறது, அதே நேரத்தில் ப்ரிமார்டியத்தில் GA சமிக்ஞை செயல்பாடு குறைகிறது (படம் 4c, d).
GID1b மற்றும் GID1c ஏற்பிகளின் பரவல் (மேலே காண்க) GA ஏற்பிகளின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு SAM இல் GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் வடிவத்தை வடிவமைக்க உதவுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. GA இன் வேறுபட்ட குவிப்பு இதில் ஈடுபடுமா என்று நாங்கள் யோசித்தோம். இந்த சாத்தியத்தை ஆராய, நாங்கள் nlsGPS1 GA FRET சென்சார்21 ஐப் பயன்படுத்தினோம். 100 நிமிடங்களுக்கு 10 μM GA4+7 உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட nlsGPS1 இன் SAM இல் அதிகரித்த செயல்படுத்தல் அதிர்வெண் கண்டறியப்பட்டது (துணை படம் 9a–e), இது வேர்கள்21 இல் செய்வது போல SAM இல் GA செறிவில் ஏற்படும் மாற்றங்களுக்கு nlsGPS1 பதிலளிக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. nlsGPS1 செயல்படுத்தல் அதிர்வெண்ணின் இடஞ்சார்ந்த விநியோகம் SAM இன் வெளிப்புற அடுக்குகளில் ஒப்பீட்டளவில் குறைந்த GA நிலைகளை வெளிப்படுத்தியது, ஆனால் அவை SAM இன் மையத்திலும் எல்லைகளிலும் உயர்த்தப்பட்டிருப்பதைக் காட்டியது (படம் 4e மற்றும் துணை படம் 9a,c). qmRGA ஆல் வெளிப்படுத்தப்பட்டதைப் போன்ற ஒரு இடஞ்சார்ந்த வடிவத்துடன் GA SAM இல் விநியோகிக்கப்படுகிறது என்பதை இது குறிக்கிறது. ஒரு நிரப்பு அணுகுமுறையாக, நாங்கள் SAM ஐ ஃப்ளோரசன்ட் GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) அல்லது Fl ஐ மட்டும் எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டாகக் கருதினோம். Fl சமிக்ஞை மத்திய பகுதி மற்றும் ப்ரிமார்டியம் உட்பட SAM முழுவதும் விநியோகிக்கப்பட்டது, இருப்பினும் குறைந்த தீவிரத்தில் (படம் 4j மற்றும் துணை படம் 10d). இதற்கு நேர்மாறாக, மூன்று GA-Fl களும் குறிப்பாக ப்ரிமார்டியம் எல்லைகளுக்குள்ளும், மீதமுள்ள IPR இல் மாறுபட்ட அளவுகளிலும் குவிந்தன, GA7-Fl IPR இல் மிகப்பெரிய டொமைனில் குவிந்தது (படம் 4k மற்றும் துணை படம் 10a,b). ஃப்ளோரசன்ஸ் தீவிரத்தை அளவிடுவது, Fl-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட SAM உடன் ஒப்பிடும்போது GA-Fl-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட SAM இல் IPR மற்றும் IPR அல்லாத தீவிர விகிதம் அதிகமாக இருந்தது என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 4l மற்றும் துணை படம் 10c). ஒன்றாக, இந்த முடிவுகள் உறுப்பு எல்லைக்கு அருகில் அமைந்துள்ள IPR செல்களில் GA அதிக செறிவுகளில் இருப்பதைக் குறிக்கிறது. இது SAM GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் வடிவம், உறுப்பு எல்லைகளுக்கு அருகிலுள்ள IPR செல்களில் GA ஏற்பிகளின் வேறுபட்ட வெளிப்பாடு மற்றும் GA இன் வேறுபட்ட குவிப்பு ஆகிய இரண்டிலிருந்தும் விளைகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. எனவே, எங்கள் பகுப்பாய்வு GA சமிக்ஞையின் எதிர்பாராத இடஞ்சார்ந்த வடிவத்தை வெளிப்படுத்தியது, SAM இன் மையத்திலும் முதன்மையிலும் குறைந்த செயல்பாடு மற்றும் புறப் பகுதியில் IPR இல் அதிக செயல்பாடு.
SAM இல் வேறுபட்ட GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் பங்கைப் புரிந்து கொள்ள, SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS இன் நிகழ்நேர நேர-இடைவெளி இமேஜிங்கைப் பயன்படுத்தி GA சமிக்ஞை செயல்பாடு, செல் விரிவாக்கம் மற்றும் செல் பிரிவு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். வளர்ச்சி ஒழுங்குமுறையில் GA இன் பங்கைக் கருத்தில் கொண்டு, செல் விரிவாக்க அளவுருக்களுடன் ஒரு நேர்மறையான தொடர்பு எதிர்பார்க்கப்பட்டது. எனவே, முதலில் GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டு வரைபடங்களை செல் மேற்பரப்பு வளர்ச்சி விகிதத்தின் வரைபடங்களுடன் (கொடுக்கப்பட்ட கலத்திற்கான செல் விரிவாக்கத்தின் வலிமைக்கும் பிரிவின் போது மகள் செல்களுக்கும் ஒரு ப்ராக்ஸியாக) மற்றும் செல் விரிவாக்கத்தின் திசையை அளவிடும் வளர்ச்சி அனிசோட்ரோபியின் வரைபடங்களுடன் ஒப்பிட்டோம் (கொடுக்கப்பட்ட கலத்திற்கும் பிரிவின் போது மகள் செல்களுக்கும் இங்கு பயன்படுத்தப்படுகிறது; படம் 5a,b, முறைகள் மற்றும் துணை முறைகளைப் பார்க்கவும்). SAM செல் மேற்பரப்பு வளர்ச்சி விகிதத்தின் எங்கள் வரைபடங்கள் முந்தைய அவதானிப்புகளுடன் ஒத்துப்போகின்றன38,39, எல்லையில் குறைந்தபட்ச வளர்ச்சி விகிதங்கள் மற்றும் வளரும் பூக்களில் அதிகபட்ச வளர்ச்சி விகிதங்கள் (படம் 5a). முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA), GA சமிக்ஞை செயல்பாடு செல் மேற்பரப்பு வளர்ச்சி தீவிரத்துடன் எதிர்மறையாக தொடர்புடையது என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 5c). GA சமிக்ஞை உள்ளீடு மற்றும் வளர்ச்சி தீவிரம் உள்ளிட்ட மாறுபாட்டின் முக்கிய அச்சுகள், உயர் CLV3 வெளிப்பாட்டால் தீர்மானிக்கப்பட்ட திசைக்கு செங்குத்தாக இருப்பதையும், மீதமுள்ள பகுப்பாய்வுகளில் SAM மையத்திலிருந்து செல்கள் விலக்கப்படுவதை உறுதிப்படுத்துவதையும் நாங்கள் காண்பித்தோம். ஸ்பியர்மேன் தொடர்பு பகுப்பாய்வு PCA முடிவுகளை உறுதிப்படுத்தியது (படம் 5d), IPR இல் அதிக GA சமிக்ஞைகள் அதிக செல் விரிவாக்கத்தை ஏற்படுத்தவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், தொடர்பு பகுப்பாய்வு GA சமிக்ஞை செயல்பாடு மற்றும் வளர்ச்சி அனிசோட்ரோபிக்கு இடையே ஒரு சிறிய நேர்மறையான தொடர்பை வெளிப்படுத்தியது (படம் 5c, d), IPR இல் அதிக GA சமிக்ஞை செல் வளர்ச்சியின் திசையையும், ஒருவேளை செல் பிரிவு தளத்தின் நிலையையும் பாதிக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.
a, b SAM இல் சராசரி மேற்பரப்பு வளர்ச்சி (a) மற்றும் வளர்ச்சி அனிசோட்ரோபி (b) ஆகியவற்றின் வெப்ப வரைபடங்கள் ஏழு சுயாதீன தாவரங்களுக்கு மேல் சராசரியாக இருந்தன (முறையே செல் விரிவாக்கத்தின் வலிமை மற்றும் திசைக்கு ப்ராக்ஸிகளாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன). c PCA பகுப்பாய்வில் பின்வரும் மாறிகள் அடங்கும்: GA சமிக்ஞை, மேற்பரப்பு வளர்ச்சி தீவிரம், மேற்பரப்பு வளர்ச்சி அனிசோட்ரோபி மற்றும் CLV3 வெளிப்பாடு. PCA கூறு 1 முக்கியமாக மேற்பரப்பு வளர்ச்சி தீவிரத்துடன் எதிர்மறையாக தொடர்புடையது மற்றும் GA சமிக்ஞையுடன் நேர்மறையாக தொடர்புடையது. PCA கூறு 2 முக்கியமாக மேற்பரப்பு வளர்ச்சி அனிசோட்ரோபியுடன் நேர்மறையாக தொடர்புடையது மற்றும் CLV3 வெளிப்பாட்டுடன் எதிர்மறையாக தொடர்புடையது. சதவீதங்கள் ஒவ்வொரு கூறுகளாலும் விளக்கப்பட்ட மாறுபாட்டைக் குறிக்கின்றன. d CZ ஐத் தவிர்த்து திசு அளவில் GA சமிக்ஞை, மேற்பரப்பு வளர்ச்சி தீவிரம் மற்றும் மேற்பரப்பு வளர்ச்சி அனிசோட்ரோபிக்கு இடையிலான ஸ்பியர்மேன் தொடர்பு பகுப்பாய்வு. வலதுபுறத்தில் உள்ள எண் இரண்டு மாறிகளுக்கு இடையிலான ஸ்பியர்மேன் ரோ மதிப்பாகும். தொடர்பு/எதிர்மறை தொடர்பு மிகவும் குறிப்பிடத்தக்கதாக இருக்கும் நிகழ்வுகளை நட்சத்திரக் குறிகள் குறிக்கின்றன. கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி மூலம் Col-0 SAM L1 செல்களின் 3D காட்சிப்படுத்தல். 10 மணிநேரத்தில் SAM இல் (ஆனால் ப்ரிமார்டியம் அல்ல) உருவாகும் புதிய செல் சுவர்கள் அவற்றின் கோண மதிப்புகளுக்கு ஏற்ப வண்ணமயமாக்கப்படுகின்றன. வண்ணப் பட்டை கீழ் வலது மூலையில் காட்டப்பட்டுள்ளது. செருகல் 0 மணிநேரத்தில் தொடர்புடைய 3D படத்தைக் காட்டுகிறது. சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டது, இதே போன்ற முடிவுகளுடன். f பெட்டி வரைபடங்கள் IPR மற்றும் IPR அல்லாத Col-0 SAM இல் செல் பிரிவு விகிதங்களைக் காட்டுகின்றன (n = 10 சுயாதீன தாவரங்கள்). மையக் கோடு சராசரியைக் காட்டுகிறது, மேலும் பெட்டி எல்லைகள் 25வது மற்றும் 75வது சதவீதங்களைக் குறிக்கின்றன. R மென்பொருளால் தீர்மானிக்கப்பட்ட குறைந்தபட்ச மற்றும் அதிகபட்ச மதிப்புகளை விஸ்கர்கள் குறிக்கின்றன. P மதிப்புகள் வெல்ச்சின் இரண்டு-வால் t-சோதனையுடன் பெறப்பட்டன. g, h SAM இன் மையத்திலிருந்து (வெள்ளை புள்ளியிடப்பட்ட கோடு) ரேடியல் திசையைப் பொறுத்து புதிய செல் சுவரின் (மெஜந்தா) கோணத்தை எவ்வாறு அளவிடுவது என்பதைக் காட்டும் திட்ட வரைபடம் (g) (வெள்ளை புள்ளியிடப்பட்ட கோடு) (அதாவது, 0–90° மட்டுமே கருதப்படுகிறது), மற்றும் (h) மெரிஸ்டெமுக்குள் உள்ள சுற்றளவு/பக்கவாட்டு மற்றும் ரேடியல் திசைகள். i SAM (அடர் நீலம்), IPR (நடுத்தர நீலம்) மற்றும் IPR அல்லாத (வெளிர் நீலம்) முழுவதும் செல் பிரிவு தள நோக்குநிலையின் அதிர்வெண் ஹிஸ்டோகிராம்கள் முறையே. P மதிப்புகள் இரண்டு வால் கொண்ட கோல்மோகோரோவ்-ஸ்மிர்னோவ் சோதனை மூலம் பெறப்பட்டன. இந்த சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டது, இதே போன்ற முடிவுகள். j முறையே P3 (வெளிர் பச்சை), P4 (நடுத்தர பச்சை) மற்றும் P5 (அடர் பச்சை) ஆகியவற்றைச் சுற்றியுள்ள IPR இன் செல் பிரிவு தள நோக்குநிலையின் அதிர்வெண் ஹிஸ்டோகிராம்கள். P மதிப்புகள் இரண்டு வால் கொண்ட கோல்மோகோரோவ்-ஸ்மிர்னோவ் சோதனை மூலம் பெறப்பட்டன. இதே போன்ற முடிவுகளுடன் சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டது.
எனவே, அடுத்ததாக, மதிப்பீட்டின் போது புதிதாக உருவாக்கப்பட்ட செல் சுவர்களை அடையாளம் காண்பதன் மூலம் GA சமிக்ஞைக்கும் செல் பிரிவு செயல்பாட்டிற்கும் இடையிலான தொடர்பை ஆராய்ந்தோம் (படம் 5e). இந்த அணுகுமுறை செல் பிரிவின் அதிர்வெண் மற்றும் திசையை அளவிட எங்களுக்கு அனுமதித்தது. ஆச்சரியப்படும் விதமாக, IPR மற்றும் மீதமுள்ள SAM (IPR அல்லாத, படம் 5f) ஆகியவற்றில் உள்ள செல் பிரிவுகளின் அதிர்வெண் ஒத்திருப்பதைக் கண்டறிந்தோம், இது IPR மற்றும் IPR அல்லாத செல்களுக்கு இடையிலான GA சமிக்ஞையில் உள்ள வேறுபாடுகள் செல் பிரிவை கணிசமாக பாதிக்காது என்பதைக் குறிக்கிறது. இதுவும், GA சமிக்ஞைக்கும் வளர்ச்சி அனிசோட்ரோபிக்கும் இடையிலான நேர்மறையான தொடர்பும், GA சமிக்ஞை செயல்பாடு செல் பிரிவு தளத்தின் நோக்குநிலையை பாதிக்குமா என்பதைக் கருத்தில் கொள்ள எங்களைத் தூண்டியது. புதிய செல் சுவரின் நோக்குநிலையை மெரிஸ்டெம் மையத்தையும் புதிய செல் சுவரின் மையத்தையும் இணைக்கும் ரேடியல் அச்சுடன் ஒப்பிடும்போது ஒரு கடுமையான கோணமாக அளந்தோம் (படம் 5e-i) மேலும் ரேடியல் அச்சுடன் ஒப்பிடும்போது 90°க்கு நெருக்கமான கோணங்களில் செல்கள் பிரிக்கும் தெளிவான போக்கைக் கண்டோம், அதிகபட்ச அதிர்வெண்கள் 70–80° (23.28%) மற்றும் 80–90° (22.62%) (படம் 5e,i) இல் காணப்பட்டன, இது சுற்றளவு/குறுக்கு திசையில் உள்ள செல் பிரிவுகளுக்கு ஒத்திருக்கிறது (படம் 5h). இந்த செல் பிரிவு நடத்தைக்கு GA சமிக்ஞையின் பங்களிப்பை ஆராய, IPR மற்றும் IPR அல்லாதவற்றில் உள்ள செல் பிரிவு அளவுருக்களை தனித்தனியாக பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம் 5i). ஐபிஆர் செல்களில் பிரிவு கோண பரவல் ஐபிஆர் அல்லாத செல்கள் அல்லது முழு எஸ்ஏஎம்மில் உள்ள செல்களில் இருந்து வேறுபடுவதை நாங்கள் கவனித்தோம், ஐபிஆர் செல்கள் பக்கவாட்டு/வட்ட செல் பிரிவுகளின் அதிக விகிதத்தைக் காட்டுகின்றன, அதாவது, 70–80° மற்றும் 80–90° (முறையே 33.86% மற்றும் 30.71%) (படம் 5i). எனவே, எங்கள் அவதானிப்புகள் உயர் GA சமிக்ஞைக்கும் சுற்றளவு திசைக்கு நெருக்கமான செல் பிரிவு விமான நோக்குநிலைக்கும் இடையிலான தொடர்பை வெளிப்படுத்தின, இது GA சமிக்ஞை செயல்பாடு மற்றும் வளர்ச்சி அனிசோட்ரோபிக்கு இடையிலான தொடர்பைப் போன்றது (படம் 5c, d). இந்த சங்கத்தின் இடஞ்சார்ந்த பாதுகாப்பை மேலும் நிறுவ, P4 இலிருந்து தொடங்கும் இந்த பகுதியில் மிக உயர்ந்த GA சமிக்ஞை செயல்பாடு கண்டறியப்பட்டதால், P3 இலிருந்து தொடங்கும் ப்ரிமார்டியத்தைச் சுற்றியுள்ள ஐபிஆர் செல்களில் பிரிவு விமான நோக்குநிலையை அளந்தோம் (படம் 4). P3 மற்றும் P4 ஐச் சுற்றியுள்ள ஐபிஆரின் பிரிவு கோணங்கள் புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் காட்டவில்லை, இருப்பினும் P4 ஐச் சுற்றியுள்ள ஐபிஆரில் பக்கவாட்டு செல் பிரிவுகளின் அதிகரித்த அதிர்வெண் காணப்பட்டது (படம் 5j). இருப்பினும், P5 ஐச் சுற்றியுள்ள IPR செல்களில், செல் பிரிவு தளத்தின் நோக்குநிலையில் உள்ள வேறுபாடு புள்ளிவிவர ரீதியாக முக்கியத்துவம் வாய்ந்ததாக மாறியது, குறுக்கு செல் பிரிவுகளின் அதிர்வெண்ணில் கூர்மையான அதிகரிப்பு (படம் 5j). ஒன்றாக, இந்த முடிவுகள் GA சமிக்ஞை SAM இல் செல் பிரிவுகளின் நோக்குநிலையைக் கட்டுப்படுத்த முடியும் என்பதைக் குறிக்கின்றன, இது முந்தைய அறிக்கைகளுடன் ஒத்துப்போகிறது40,41 உயர் GA சமிக்ஞை IPR இல் செல் பிரிவுகளின் பக்கவாட்டு நோக்குநிலையைத் தூண்டக்கூடும்.
IPR இல் உள்ள செல்கள் ப்ரிமார்டியாவில் இணைக்கப்படாமல், இன்டர்நோடுகளில் இணைக்கப்படும் என்று கணிக்கப்பட்டுள்ளது2,42,43. IPR இல் உள்ள செல் பிரிவுகளின் குறுக்கு நோக்குநிலை, இன்டர்நோடுகளில் எபிடெர்மல் செல்களின் இணையான நீளமான வரிசைகளின் வழக்கமான அமைப்பை ஏற்படுத்தக்கூடும். மேலே விவரிக்கப்பட்ட எங்கள் அவதானிப்புகள், செல் பிரிவின் திசையை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் GA சிக்னலிங் இந்த செயல்பாட்டில் ஒரு பங்கை வகிக்கக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
பல DELLA மரபணுக்களின் செயல்பாடு இழப்பு ஒரு கட்டமைப்பு GA பதிலை ஏற்படுத்துகிறது, மேலும் இந்த கருதுகோளை சோதிக்க டெல்லா மரபுபிறழ்ந்தவர்களைப் பயன்படுத்தலாம்44. SAM இல் உள்ள ஐந்து DELLA மரபணுக்களின் வெளிப்பாடு வடிவங்களை நாங்கள் முதலில் பகுப்பாய்வு செய்தோம். GUS வரியின் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் இணைவு45 GAI, RGA, RGL1, மற்றும் RGL2 (மிகக் குறைந்த அளவிற்கு) SAM இல் வெளிப்படுத்தப்பட்டதை வெளிப்படுத்தியது (துணை படம் 11a–d). இன் சிட்டு கலப்பினமாக்கல் GAI mRNA குறிப்பாக ப்ரிமார்டியா மற்றும் வளரும் பூக்களில் குவிகிறது என்பதை மேலும் நிரூபித்தது (துணை படம் 11e). RGL1 மற்றும் RGL3 mRNA SAM விதானம் முழுவதும் மற்றும் பழைய பூக்களில் கண்டறியப்பட்டன, அதேசமயம் RGL2 mRNA எல்லைப் பகுதியில் அதிகமாக இருந்தது (துணை படம் 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM இன் கன்ஃபோகல் இமேஜிங் இன் சிட்டு கலப்பினத்தால் கவனிக்கப்பட்ட வெளிப்பாட்டை உறுதிப்படுத்தியது மற்றும் SAM இன் மையப் பகுதியில் RGL3 புரதம் குவிவதைக் காட்டியது (துணை படம் 11i). pRGA::GFP-RGA வரியைப் பயன்படுத்தி, SAM இல் RGA புரதம் குவிகிறது என்பதையும் கண்டறிந்தோம், ஆனால் P4 இலிருந்து தொடங்கும் எல்லையில் அதன் மிகுதி குறைகிறது (துணை படம் 11j). குறிப்பாக, RGL3 மற்றும் RGA இன் வெளிப்பாடு வடிவங்கள் qmRGA ஆல் கண்டறியப்பட்டபடி, IPR இல் அதிக GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டுடன் ஒத்துப்போகின்றன (படம் 4). மேலும், இந்த தரவுகள் அனைத்து DELLA களும் SAM இல் வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதையும் அவற்றின் வெளிப்பாடு ஒட்டுமொத்தமாக முழு SAM ஐயும் உள்ளடக்கியது என்பதையும் குறிக்கிறது.
அடுத்து, காட்டு வகை SAM (Ler, control) மற்றும் gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (உலகளாவிய) மரபுபிறழ்வுகளில் உள்ள செல் பிரிவு அளவுருக்களை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம் 6a, b). சுவாரஸ்யமாக, காட்டு வகையுடன் ஒப்பிடும்போது டெல்லா உலகளாவிய பிறழ்வு SAM இல் செல் பிரிவு கோண அதிர்வெண்களின் விநியோகத்தில் புள்ளிவிவர ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க மாற்றத்தைக் கண்டோம் (படம் 6c). டெல்லா உலகளாவிய பிறழ்வில் இந்த மாற்றம் 80–90° கோணங்களின் அதிர்வெண் அதிகரிப்பால் ஏற்பட்டது (34.71% vs. 24.55%) மற்றும், குறைந்த அளவிற்கு, 70–80° கோணங்கள் (23.78% vs. 20.18%), அதாவது, குறுக்குவெட்டு செல் பிரிவுகளுக்கு ஒத்திருக்கிறது (படம் 6c). குறுக்குவெட்டு அல்லாத பிரிவுகளின் அதிர்வெண் (0–60°) டெல்லா உலகளாவிய பிறழ்விலும் குறைவாக இருந்தது (படம் 6c). டெல்லா குளோபல் மியூட்டண்டின் SAM இல் குறுக்கு செல் பிரிவுகளின் அதிர்வெண் கணிசமாக அதிகரித்தது (படம் 6b). காட்டு வகையுடன் ஒப்பிடும்போது டெல்லா குளோபல் மியூட்டண்டில் IPR இல் குறுக்கு செல் பிரிவுகளின் அதிர்வெண் அதிகமாக இருந்தது (படம் 6d). IPR பகுதிக்கு வெளியே, காட்டு வகை செல் பிரிவு கோணங்களின் சீரான விநியோகத்தைக் கொண்டிருந்தது, அதேசமயம் டெல்லா குளோபல் மியூட்டண்ட் IPR (படம் 6e) போன்ற தொடுநிலைப் பிரிவுகளை விரும்பியது. GA குவிக்கும் GA-செயலற்ற மியூட்டண்ட் பின்னணியான ga2 ஆக்சிடேஸ் (ga2ox) ஐந்தெழுத்து மியூட்டண்டுகள் (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, மற்றும் ga2ox6-2) ஆகியவற்றின் SAM இல் செல் பிரிவுகளின் நோக்குநிலையையும் நாங்கள் அளவிட்டோம். GA அளவுகளின் அதிகரிப்பிற்கு இணங்க, ஐந்தடுப்புள் ga2ox விகாரி மஞ்சரியின் SAM, Col-0 ஐ விடப் பெரியதாக இருந்தது (துணை படம் 12a, b), மேலும் Col-0 உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​ஐந்தடுப்புள் ga2ox SAM, செல் பிரிவு கோணங்களின் தனித்துவமான வேறுபட்ட பரவலைக் காட்டியது, கோண அதிர்வெண் 50° இலிருந்து 90° வரை அதிகரித்தது, அதாவது மீண்டும் தொடுநிலைப் பிரிவுகளுக்கு சாதகமாக இருந்தது (துணை படம் 12a–c). இவ்வாறு, GA சமிக்ஞை மற்றும் GA குவிப்பின் அமைப்புரீதியான செயல்படுத்தல் IPR மற்றும் SAM இன் மீதமுள்ள பகுதிகளில் பக்கவாட்டு செல் பிரிவுகளைத் தூண்டுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறோம்.
a, b கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி PI-கறை படிந்த Ler (a) மற்றும் உலகளாவிய டெல்லா விகாரி (b) SAM இன் L1 அடுக்கின் 3D காட்சிப்படுத்தல். 10-மணிநேர காலத்தில் SAM இல் (ஆனால் ப்ரிமார்டியம் அல்ல) உருவாக்கப்பட்ட புதிய செல் சுவர்கள் காட்டப்பட்டு அவற்றின் கோண மதிப்புகளுக்கு ஏற்ப வண்ணம் தீட்டப்படுகின்றன. செருகல் SAM ஐ 0 மணிநேரத்தில் காட்டுகிறது. வண்ணப் பட்டை கீழ் வலது மூலையில் காட்டப்பட்டுள்ளது. (b) இல் உள்ள அம்பு உலகளாவிய டெல்லா விகாரிகளில் சீரமைக்கப்பட்ட செல் கோப்புகளின் உதாரணத்தைக் குறிக்கிறது. இதே போன்ற முடிவுகளுடன் சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது. ce முழு SAM (d), IPR (e), மற்றும் Ler மற்றும் உலகளாவிய டெல்லா இடையே IPR (f) அல்லாத செல் பிரிவு விமான நோக்குநிலைகளின் அதிர்வெண் விநியோகத்தின் ஒப்பீடு. இரண்டு வால் கொண்ட கோல்மோகோரோவ்-ஸ்மிர்னோவ் சோதனையைப் பயன்படுத்தி P மதிப்புகள் பெறப்பட்டன. f, g Col-0 (i) மற்றும் pCUC2::gai-1-VENUS (j) டிரான்ஸ்ஜெனிக் தாவரங்களின் PI-கறை படிந்த SAM இன் கன்ஃபோகல் படங்களின் 3D காட்சிப்படுத்தல். (a, b) பேனல்கள் SAM இல் 10 மணி நேரத்திற்குள் உருவாக்கப்பட்ட புதிய செல் சுவர்களைக் காட்டுகின்றன (ஆனால் ப்ரிமார்டியா அல்ல). இதே போன்ற முடிவுகளுடன் இந்த சோதனை இரண்டு முறை மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டது. h–j Col-0 மற்றும் pCUC2::gai-1-VENUS தாவரங்களுக்கு இடையில் முழு SAM (h), IPR (i) மற்றும் IPR அல்லாத (j) இல் அமைந்துள்ள செல் பிரிவு விமான நோக்குநிலைகளின் அதிர்வெண் பரவலின் ஒப்பீடு. இரண்டு வால் கொண்ட கோல்மோகோரோவ்-ஸ்மிர்னோவ் சோதனையைப் பயன்படுத்தி P மதிப்புகள் பெறப்பட்டன.
அடுத்து, குறிப்பாக IPR இல் GA சமிக்ஞையைத் தடுப்பதன் விளைவை நாங்கள் சோதித்தோம். இதற்காக, VENUS உடன் இணைக்கப்பட்ட ஒரு ஆதிக்க எதிர்மறை gai-1 புரதத்தின் வெளிப்பாட்டை இயக்க கோட்டிலிடன் கப் 2 (CUC2) ஊக்குவிப்பாளரைப் பயன்படுத்தினோம் (pCUC2::gai-1-VENUS வரிசையில்). காட்டு-வகை SAM இல், CUC2 ஊக்குவிப்பாளர் P4 முதல் எல்லை செல்கள் உட்பட SAM இல் உள்ள பெரும்பாலான IPR களின் வெளிப்பாட்டை இயக்குகிறார், மேலும் pCUC2::gai-1-VENUS தாவரங்களில் இதே போன்ற குறிப்பிட்ட வெளிப்பாடு காணப்பட்டது (கீழே காண்க). pCUC2::gai-1-VENUS தாவரங்களின் SAM அல்லது IPR முழுவதும் செல் பிரிவு கோணங்களின் விநியோகம் காட்டு வகையிலிருந்து கணிசமாக வேறுபட்டதாக இல்லை, இருப்பினும் எதிர்பாராத விதமாக இந்த தாவரங்களில் IPR இல்லாத செல்கள் 80-90° அதிக அதிர்வெண்ணில் பிரிக்கப்பட்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 6f-j).
செல் பிரிவின் திசை SAM இன் வடிவவியலைப் பொறுத்தது, குறிப்பாக திசு வளைவால் உருவாக்கப்படும் இழுவிசை அழுத்தத்தைப் பொறுத்தது என்று கூறப்படுகிறது46. எனவே, டெல்லா குளோபல் மியூட்டண்ட் மற்றும் pCUC2::gai-1-VENUS தாவரங்களில் SAM இன் வடிவம் மாற்றப்பட்டதா என்று நாங்கள் கேட்டோம். முன்னர் அறிவிக்கப்பட்டபடி12, டெல்லா குளோபல் மியூட்டண்ட் SAM இன் அளவு காட்டு வகையை விட பெரியதாக இருந்தது (துணை படம் 13a, b, d). CLV3 மற்றும் STM RNA இன் இன் சிட்டு கலப்பினமாக்கல் டெல்லா மியூட்டண்ட்களில் மெரிஸ்டெம் விரிவாக்கத்தை உறுதிப்படுத்தியது மற்றும் ஸ்டெம் செல் இடத்தின் பக்கவாட்டு விரிவாக்கத்தை மேலும் காட்டியது (துணை படம் 13e, f, h, i). இருப்பினும், SAM வளைவு இரண்டு மரபணு வகைகளிலும் ஒத்திருந்தது (துணை படம் 13k, m, n, p). காட்டு வகையுடன் ஒப்பிடும்போது வளைவில் மாற்றம் இல்லாமல் gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant இல் இதேபோன்ற அளவு அதிகரிப்பை நாங்கள் கவனித்தோம் (துணை படம் 13c, d, g, j, l, o, p). della quadruple mutant இல் செல் பிரிவு நோக்குநிலையின் அதிர்வெண் பாதிக்கப்பட்டது, ஆனால் della monoliptic mutant ஐ விட குறைந்த அளவிற்கு (துணை படம் 12d-f). இந்த மருந்தளவு விளைவு, வளைவில் விளைவு இல்லாததுடன் சேர்ந்து, Della quadruple mutant இல் எஞ்சியிருக்கும் RGL3 செயல்பாடு DELLA செயல்பாட்டின் இழப்பால் ஏற்படும் செல் பிரிவு நோக்குநிலையில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் கட்டுப்படுத்துகிறது என்றும், SAM வடிவவியலில் ஏற்படும் மாற்றங்களுக்குப் பதிலாக GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டில் ஏற்படும் மாற்றங்களுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக பக்கவாட்டு செல் பிரிவுகளில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் நிகழ்கின்றன என்றும் கூறுகிறது. மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, CUC2 ஊக்குவிப்பாளர் P4 இல் தொடங்கி SAM இல் IPR வெளிப்பாட்டை இயக்குகிறார் (துணை படம் 14a, b), இதற்கு நேர்மாறாக, pCUC2::gai-1-VENUS SAM குறைந்த அளவு ஆனால் அதிக வளைவைக் கொண்டிருந்தது (துணை படம் 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM உருவ அமைப்பில் ஏற்பட்ட இந்த மாற்றம் காட்டு வகையுடன் ஒப்பிடும்போது இயந்திர அழுத்தங்களின் வேறுபட்ட விநியோகத்தை ஏற்படுத்தக்கூடும், இதில் அதிக சுற்றளவு அழுத்தங்கள் SAM மையத்திலிருந்து குறுகிய தூரத்தில் தொடங்குகின்றன47. மாற்றாக, pCUC2::gai-1-VENUS SAM உருவ அமைப்பில் ஏற்பட்ட மாற்றங்கள் டிரான்ஸ்ஜீன் வெளிப்பாடு48 ஆல் தூண்டப்பட்ட பிராந்திய இயந்திர பண்புகளில் ஏற்பட்ட மாற்றங்களால் ஏற்படக்கூடும். இரண்டு சந்தர்ப்பங்களிலும், இது GA சமிக்ஞையில் ஏற்படும் மாற்றங்களின் விளைவுகளை ஓரளவு ஈடுசெய்யக்கூடும், இது செல்கள் சுற்றளவு/குறுக்கு நோக்குநிலையில் பிரிக்கும் வாய்ப்பை அதிகரிப்பதன் மூலம், எங்கள் அவதானிப்புகளை விளக்குகிறது.
ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், IPR இல் செல் பிரிவு தளத்தின் பக்கவாட்டு நோக்குநிலையில் உயர் GA சமிக்ஞை செயலில் பங்கு வகிக்கிறது என்பதை எங்கள் தரவு உறுதிப்படுத்துகிறது. மேலும், மெரிஸ்டெம் வளைவு IPR இல் செல் பிரிவு தளத்தின் நோக்குநிலையையும் பாதிக்கிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன.
உயர் GA சமிக்ஞை செயல்பாடு காரணமாக, IPR இல் பிரிவு தளத்தின் குறுக்கு நோக்குநிலை, GA, பின்னர் மேல்தோல் இடைநிலையில் காணப்படும் செல்லுலார் அமைப்பை வரையறுக்க SAM க்குள் உள்ள மேல்தோலில் ஒரு ரேடியல் செல் கோப்பை முன்கூட்டியே ஒழுங்கமைக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. உண்மையில், டெல்லா குளோபல் மியூட்டண்டுகளின் SAM படங்களில் இதுபோன்ற செல் கோப்புகள் அடிக்கடி காணப்பட்டன (படம் 6b). எனவே, SAM இல் GA சமிக்ஞையின் இடஞ்சார்ந்த வடிவத்தின் வளர்ச்சி செயல்பாட்டை மேலும் ஆராய, காட்டு-வகை (Ler மற்றும் Col-0), டெல்லா குளோபல் மியூட்டண்டுகள் மற்றும் pCUC2::gai-1-VENUS டிரான்ஸ்ஜெனிக் தாவரங்களில் IPR இல் உள்ள செல்களின் இடஞ்சார்ந்த அமைப்பை பகுப்பாய்வு செய்ய நேர-இடைவெளி இமேஜிங்கைப் பயன்படுத்தினோம்.
IPR இல் GA சமிக்ஞை செயல்பாடு P1/P2 இலிருந்து அதிகரித்து P4 இல் உச்சத்தை எட்டியதாக qmRGA காட்டியதை நாங்கள் கண்டறிந்தோம், மேலும் இந்த முறை காலப்போக்கில் மாறாமல் இருந்தது (படம் 4a–f மற்றும் துணை படம் 8c–f, k). அதிகரிக்கும் GA சமிக்ஞையுடன் IPR இல் உள்ள செல்களின் இடஞ்சார்ந்த அமைப்பை பகுப்பாய்வு செய்ய, முதல் கவனிப்புக்குப் பிறகு 34 மணிநேரம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட அவற்றின் வளர்ச்சி விதியின் படி, அதாவது, இரண்டுக்கும் மேற்பட்ட பிளாஸ்டிட் நேரங்கள் என Ler IPR செல்களை மேலேயும் P4 இன் பக்கங்களிலும் லேபிளிட்டோம், P1/P2 இலிருந்து P4 வரையிலான ப்ரிமார்டியம் வளர்ச்சியின் போது IPR செல்களைப் பின்பற்ற எங்களுக்கு அனுமதித்தது. நாங்கள் மூன்று வெவ்வேறு வண்ணங்களைப் பயன்படுத்தினோம்: P4 க்கு அருகிலுள்ள ப்ரிமார்டியத்தில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட செல்களுக்கு மஞ்சள், IPR இல் இருந்த செல்களுக்கு பச்சை, மற்றும் இரண்டு செயல்முறைகளிலும் பங்கேற்ற செல்களுக்கு ஊதா (படம் 7a–c). t0 (0 h) இல், P4 க்கு முன்னால் 1-2 அடுக்கு IPR செல்கள் தெரிந்தன (படம் 7a). எதிர்பார்த்தபடி, இந்த செல்கள் பிரிக்கப்பட்டபோது, ​​அவை முக்கியமாக குறுக்குவெட்டு பிரிவு தளம் வழியாகச் செய்தன (படங்கள் 7a–c). Col-0 SAM ஐப் பயன்படுத்தி இதே போன்ற முடிவுகள் பெறப்பட்டன (P3 ஐ மையமாகக் கொண்டது, அதன் எல்லை Ler இல் P4 ஐப் போலவே மடிகிறது), இருப்பினும் இந்த மரபணு வகைகளில் மலர் எல்லையில் உருவாக்கப்பட்ட மடிப்பு IPR செல்களை மிக விரைவாக மறைத்தது (படம் 7g–i). இதனால், IPR செல்களின் பிரிவு முறை செல்களை இடைக்கணுக்களில் உள்ளதைப் போல ரேடியல் வரிசைகளாக முன்கூட்டியே ஒழுங்கமைக்கிறது. ரேடியல் வரிசைகளின் அமைப்பு மற்றும் அடுத்தடுத்த உறுப்புகளுக்கு இடையில் IPR செல்களின் உள்ளூர்மயமாக்கல் ஆகியவை இந்த செல்கள் இடைக்கணு முன்னோடிகள் என்பதைக் குறிக்கின்றன.
இங்கே, qmRGA என்ற ரேஷியோமெட்ரிக் GA சிக்னலிங் பயோசென்சரை நாங்கள் உருவாக்கினோம், இது ஒருங்கிணைந்த GA மற்றும் GA ஏற்பி செறிவுகளின் விளைவாக ஏற்படும் GA சிக்னலிங் செயல்பாட்டின் அளவு வரைபடத்தை அனுமதிக்கிறது, அதே நேரத்தில் எண்டோஜெனஸ் சிக்னலிங் பாதைகளில் குறுக்கீட்டைக் குறைக்கிறது, இதன் மூலம் செல்லுலார் மட்டத்தில் GA செயல்பாடு குறித்த தகவல்களை வழங்குகிறது. இந்த நோக்கத்திற்காக, நாங்கள் மாற்றியமைக்கப்பட்ட DELLA புரதமான mRGA ஐ உருவாக்கினோம், இது DELLA தொடர்பு கூட்டாளர்களை பிணைக்கும் திறனை இழந்துவிட்டது, ஆனால் GA- தூண்டப்பட்ட புரோட்டியோலிசிஸுக்கு உணர்திறன் கொண்டது. qmRGA GA அளவுகளில் வெளிப்புற மற்றும் எண்டோஜெனஸ் மாற்றங்களுக்கு பதிலளிக்கிறது, மேலும் அதன் டைனமிக் உணர்திறன் பண்புகள் வளர்ச்சியின் போது GA சிக்னலிங் செயல்பாட்டில் இடஞ்சார்ந்த தற்காலிக மாற்றங்களை மதிப்பிடுவதை செயல்படுத்துகின்றன. qmRGA மிகவும் நெகிழ்வான கருவியாகும், ஏனெனில் அதன் வெளிப்பாட்டிற்குப் பயன்படுத்தப்படும் ஊக்குவிப்பாளரை மாற்றுவதன் மூலம் (தேவைப்பட்டால்), மேலும் GA சிக்னலிங் பாதையின் பாதுகாக்கப்பட்ட தன்மை மற்றும் ஆஞ்சியோஸ்பெர்ம்கள் முழுவதும் PFYRE மையக்கருத்தைக் கருத்தில் கொண்டு, இது மற்ற உயிரினங்களுக்கு மாற்றப்படும். இதற்கு இணங்க, அரிசி SLR1 DELLA புரதத்தில் (HYY497AAA) சமமான பிறழ்வு, mRGA23 ஐப் போலவே, SLR1 இன் வளர்ச்சி அடக்கி செயல்பாட்டை அடக்குவதாகவும், அதன் GA-மத்தியஸ்த சிதைவை சற்றுக் குறைப்பதாகவும் காட்டப்பட்டது. குறிப்பாக, அரபிடோப்சிஸில் சமீபத்திய ஆய்வுகள், PFYRE டொமைனில் (S474L) ஒரு ஒற்றை அமினோ அமில பிறழ்வு, டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி கூட்டாளர்களுடன் தொடர்பு கொள்ளும் திறனைப் பாதிக்காமல் RGA இன் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் செயல்பாட்டை மாற்றியமைத்ததாகக் காட்டியது. இந்த பிறழ்வு mRGA இல் உள்ள 3 அமினோ அமில மாற்றுகளுக்கு மிக அருகில் இருந்தாலும், இந்த இரண்டு பிறழ்வுகளும் DELLA இன் தனித்துவமான பண்புகளை மாற்றுகின்றன என்பதை எங்கள் ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன. பெரும்பாலான டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி கூட்டாளர்கள் DELLA26,51 இன் LHR1 மற்றும் SAW டொமைன்களுடன் பிணைக்கப்பட்டாலும், PFYRE டொமைனில் உள்ள சில பாதுகாக்கப்பட்ட அமினோ அமிலங்கள் இந்த தொடர்புகளை நிலைப்படுத்த உதவும்.
தாவர கட்டமைப்பு மற்றும் மகசூல் மேம்பாட்டில் இன்டர்னோட் வளர்ச்சி ஒரு முக்கிய பண்பாகும். qmRGA, IPR இன்டர்னோட் முன்னோடி செல்களில் அதிக GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்தியது. அளவு இமேஜிங் மற்றும் மரபியலை இணைப்பதன் மூலம், GA சமிக்ஞை வடிவங்கள் SAM மேல்தோலில் வட்ட/குறுக்கு செல் பிரிவு தளங்களை மிகைப்படுத்தி, இன்டர்னோட் வளர்ச்சிக்குத் தேவையான செல் பிரிவு அமைப்பை வடிவமைக்கின்றன என்பதைக் காட்டினோம். செல் பிரிவு தள நோக்குநிலையின் பல கட்டுப்பாட்டாளர்கள் வளர்ச்சியின் போது அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளனர்52,53. GA சமிக்ஞை செயல்பாடு இந்த செல்லுலார் அளவுருவை எவ்வாறு ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதற்கான தெளிவான உதாரணத்தை எங்கள் பணி வழங்குகிறது. DELLA முன் மடிப்பு புரத வளாகங்களுடன் தொடர்பு கொள்ளலாம்41, எனவே GA சமிக்ஞை கார்டிகல் மைக்ரோடியூபுல் நோக்குநிலையை நேரடியாக பாதிப்பதன் மூலம் செல் பிரிவு தள நோக்குநிலையை ஒழுங்குபடுத்தலாம்40,41,54,55. SAM இல், அதிக GA சமிக்ஞை செயல்பாட்டின் தொடர்பு செல் நீட்சி அல்லது பிரிவு அல்ல, ஆனால் வளர்ச்சி அனிசோட்ரோபி மட்டுமே என்பதை நாங்கள் எதிர்பாராத விதமாகக் காட்டினோம், இது IPR இல் செல் பிரிவின் திசையில் GA இன் நேரடி விளைவுடன் ஒத்துப்போகிறது. இருப்பினும், இந்த விளைவு மறைமுகமாகவும் இருக்கலாம் என்பதை நாம் விலக்க முடியாது, எடுத்துக்காட்டாக GA- தூண்டப்பட்ட செல் சுவர் மென்மையாக்கத்தால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுகிறது56. செல் சுவர் பண்புகளில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் இயந்திர அழுத்தத்தைத் தூண்டுகின்றன57,58, இது கார்டிகல் மைக்ரோடியூபுல்களின் நோக்குநிலையை பாதிப்பதன் மூலம் செல் பிரிவு தளத்தின் நோக்குநிலையையும் பாதிக்கலாம்39,46,59. GA- தூண்டப்பட்ட இயந்திர அழுத்தத்தின் ஒருங்கிணைந்த விளைவுகள் மற்றும் GA ஆல் மைக்ரோடியூபுல் நோக்குநிலையை நேரடியாக ஒழுங்குபடுத்துதல் ஆகியவை இடைக்கணுக்களை வரையறுக்க IPR இல் ஒரு குறிப்பிட்ட செல் பிரிவு நோக்குநிலையை உருவாக்குவதில் ஈடுபடலாம், மேலும் இந்த யோசனையைச் சோதிக்க மேலும் ஆய்வுகள் தேவை. இதேபோல், முந்தைய ஆய்வுகள் இடைக்கணு உருவாக்கத்தைக் கட்டுப்படுத்துவதில் DELLA- ஊடாடும் புரதங்களான TCP14 மற்றும் 15 இன் முக்கியத்துவத்தை எடுத்துக்காட்டியுள்ளன60,61 மேலும் இந்த காரணிகள் இடைக்கணு வளர்ச்சியை ஒழுங்குபடுத்தும் மற்றும் GA சமிக்ஞையை பாதிக்கும் என்று காட்டப்பட்டுள்ளது2,62. DELLAக்கள் பிராசினோஸ்டீராய்டு, எத்திலீன், ஜாஸ்மோனிக் அமிலம் மற்றும் அப்சிசிக் அமிலம் (ABA) சமிக்ஞை பாதைகளுடன் 63,64 தொடர்பு கொள்கின்றன, மேலும் இந்த ஹார்மோன்கள் மைக்ரோடியூபுல் நோக்குநிலையை பாதிக்கக்கூடும் என்பதால், செல் பிரிவு நோக்குநிலையில் GA இன் விளைவுகள் மற்ற ஹார்மோன்களாலும் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படலாம்.
ஆரம்பகால சைட்டோலாஜிக்கல் ஆய்வுகள், அராபிடோப்சிஸ் SAM இன் உள் மற்றும் வெளிப்புற பகுதிகள் இரண்டும் இன்டர்னோட் வளர்ச்சிக்குத் தேவை என்பதைக் காட்டுகின்றன2,42. GA உள் திசுக்களில் செல் பிரிவை தீவிரமாக ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பது GA இன் இரட்டை செயல்பாட்டை ஆதரிக்கிறது12, SAM இல் மெரிஸ்டெம் மற்றும் இன்டர்னோட் அளவை ஒழுங்குபடுத்துவதில். திசை செல் பிரிவின் வடிவமும் உள் SAM திசுக்களில் இறுக்கமாக கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் இந்த ஒழுங்குமுறை தண்டு வளர்ச்சிக்கு அவசியம்52. உள் SAM அமைப்பில் செல் பிரிவு தளத்தை நோக்குநிலைப்படுத்துவதில் GA ஒரு பங்கை வகிக்கிறதா என்பதை ஆராய்வது சுவாரஸ்யமாக இருக்கும், இதன் மூலம் SAM க்குள் உள்ள இன்டர்னோட்களின் விவரக்குறிப்பு மற்றும் வளர்ச்சியை ஒத்திசைக்கிறது.
நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் (16 மணிநேர ஒளி, 22 °C) 1% சுக்ரோஸ் மற்றும் 1% அகார் (சிக்மா) உடன் கூடுதலாக மண்ணில் அல்லது 1x முராஷிகே-ஸ்கூக் (MS) ஊடகத்தில் (Duchefa) தாவரங்கள் செயற்கை முறையில் வளர்க்கப்பட்டன, ஹைபோகோடைல் மற்றும் வேர் வளர்ச்சி பரிசோதனைகளில் நாற்றுகள் நிலையான ஒளி மற்றும் 22 °C இல் செங்குத்துத் தகடுகளில் வளர்க்கப்பட்டன. நைட்ரேட் பரிசோதனைகளுக்கு, நீண்ட நாள் நிலைமைகளின் கீழ் போதுமான நைட்ரேட் (0 அல்லது 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-சக்சினேட், 1% சுக்ரோஸ் மற்றும் 1% A-அகார் (சிக்மா) ஆகியவற்றுடன் கூடுதலாக மாற்றியமைக்கப்பட்ட MS ஊடகத்தில் (bioWORLD தாவர ஊடகம்) தாவரங்கள் வளர்க்கப்பட்டன.
pDONR221 இல் செருகப்பட்ட GID1a cDNA, pDONR P4-P1R-pUBQ10 உடன் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு pB7m34GW இல் pUBQ10::GID1a-mCherry ஐ உருவாக்கியது. pDONR221 இல் செருகப்பட்ட IDD2 DNA, pB7RWG266 இல் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு p35S:IDD2-RFP ஐ உருவாக்கியது. pGID1b::2xmTQ2-GID1b ஐ உருவாக்க, GID1b குறியீட்டுப் பகுதியின் மேல்நோக்கி 3.9 kb துண்டு மற்றும் GID1b cDNA (1.3 kb) மற்றும் டெர்மினேட்டர் (3.4 kb) ஆகியவற்றைக் கொண்ட 4.7 kb துண்டு முதலில் துணை அட்டவணை 3 இல் உள்ள ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி பெருக்கப்பட்டு, பின்னர் முறையே pDONR P4-P1R (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) மற்றும் pDONR P2R-P3 (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) ஆகியவற்றில் செருகப்பட்டு, இறுதியாக கேட்வே குளோனிங்கைப் பயன்படுத்தி pGreen 012567 இலக்கு வெக்டரில் pDONR221 2xmTQ268 உடன் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டது. pCUC2::LSSmOrange ஐ உருவாக்க, CUC2 ஊக்குவிப்பு வரிசை (ATG இன் மேல்நோக்கி 3229 bp) மற்றும் N7 அணுக்கரு உள்ளூர்மயமாக்கல் சமிக்ஞையுடன் கூடிய பெரிய ஸ்டோக்ஸ்-மாற்றப்பட்ட mOrange (LSSmOrange)69 இன் குறியீட்டு வரிசை மற்றும் NOS டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் டெர்மினேட்டர் ஆகியவை கேட்வே 3-துண்டு மறுசீரமைப்பு அமைப்பு (இன்விட்ரஜன்) ஐப் பயன்படுத்தி pGreen கனமைசின் இலக்கு திசையனில் இணைக்கப்பட்டன. தாவர பைனரி திசையன் அக்ரோபாக்டீரியம் டியூமேஃபேசியன்ஸ் ஸ்ட்ரெய்ன் GV3101 இல் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது மற்றும் அக்ரோபாக்டீரியம் ஊடுருவல் முறையால் நிக்கோடியானா பெந்தாமியானா இலைகளிலும், மலர் டிப் முறையால் அரபிடோப்சிஸ் தாலியானா கோல்-0 இல் முறையே அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry மற்றும் pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ஆகியவை முறையே அந்தந்த கலப்புகளின் F3 மற்றும் F1 சந்ததியினரிடமிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டன.
தோராயமாக 1 செ.மீ நீளமுள்ள தளிர் முனைகளில் RNA இன் சிட்டு கலப்பினமாக்கல் செய்யப்பட்டது72, அவை சேகரிக்கப்பட்டு உடனடியாக FAA கரைசலில் (3.7% ஃபார்மால்டிஹைடு, 5% அசிட்டிக் அமிலம், 50% எத்தனால்) 4 °C க்கு முன் குளிரூட்டப்பட்டு சரி செய்யப்பட்டன. 2 × 15 நிமிட வெற்றிட சிகிச்சைகளுக்குப் பிறகு, ஃபிக்சேட்டிவ் மாற்றப்பட்டு மாதிரிகள் ஒரே இரவில் அடைகாக்கப்பட்டன. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, மற்றும் RGL3 cDNAக்கள் மற்றும் அவற்றின் 3′-UTRகளுக்கான ஆன்டிசென்ஸ் ஆய்வுகள் ஆகியவை ரோசியர் மற்றும் பலர் விவரித்தபடி துணை அட்டவணை 3 இல் காட்டப்பட்டுள்ள ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி ஒருங்கிணைக்கப்பட்டன.73. டைகோக்ஸிஜெனின்-லேபிளிடப்பட்ட ஆய்வுகள் டைகோக்ஸிஜெனின் ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி நோயெதிர்ப்புத் திறன் கண்டறியப்பட்டன (3000 மடங்கு நீர்த்தல்; ரோச், பட்டியல் எண்: 11 093 274 910), மேலும் பிரிவுகள் 5-புரோமோ-4-குளோரோ-3-இண்டோலைல் பாஸ்பேட் (BCIP, 250-மடங்கு நீர்த்தல்)/நைட்ரோப்ளூ டெட்ராசோலியம் (NBT, 200-மடங்கு நீர்த்தல்) கரைசலைக் கொண்டு சாயமிடப்பட்டன.