தாவர நுண்குழாய்களைப் பாதிக்கும் புதிய தாவர வளர்ச்சித் தடுப்பான்களாக, உர்சா மோனோஅமைடுகளைக் கண்டறிதல், அவற்றின் பண்புகளை வரையறுத்தல் மற்றும் செயல்பாட்டை மேம்படுத்துதல்.

Nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது. சிறந்த பலன்களைப் பெற, உங்கள் உலாவியின் புதிய பதிப்பைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதி செய்வதற்காக, நாங்கள் இந்தத் தளத்தை வடிவமைப்பு அல்லது ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காண்பிக்கிறோம்.
இயற்கைப் பொருட்களின் கண்டுபிடிப்பும் பயனுள்ள பயன்பாடும் மனித வாழ்க்கையை மேம்படுத்த உதவும். தாவர வளர்ச்சி தடுப்பு இரசாயனங்கள், களைகளைக் கட்டுப்படுத்த களைக்கொல்லிகளாகப் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. பல்வேறு வகையான களைக்கொல்லிகளைப் பயன்படுத்த வேண்டியதன் காரணமாக, புதிய செயல்முறைகளைக் கொண்ட சேர்மங்களைக் கண்டறிய வேண்டிய தேவை உள்ளது. இந்த ஆய்வில், நாங்கள் ஸ்ட்ரெப்டோமைசஸ் வெர்ரென்சிஸ் MK493-CF1 இலிருந்து கூமோனமைடு என்ற ஒரு புதிய N-ஆல்காக்ஸிபைரோல் சேர்மத்தைக் கண்டுபிடித்து, அதன் முழுமையான தொகுப்பு செயல்முறையை நிறுவினோம். உயிரியல் செயல்பாட்டு சோதனைகள் மூலம், உர்ஸ்-மோனோஅமைடின் ஒரு செயற்கை இடைநிலைப்பொருளாகவும், ஒரு சாத்தியமான சேர்மமாகவும் உர்ஸ்-மோனோஅமிக் அமிலம் இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம்.தாவர வளர்ச்சி தடுப்பான்மேலும், நாங்கள் அர்பெனிலாக்ஸி வழிப்பொருள் (UDA) உட்பட பல்வேறு அர்பெனோனிக் அமில வழிப்பொருட்களை உருவாக்கியுள்ளோம்; இது ஹீலா செல்களின் வளர்ச்சியைப் பாதிக்காமல் அதிக களைக்கொல்லிச் செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது. அர்மோடோனிக் அமில வழிப்பொருட்கள் தாவர நுண்குழாய்களைச் சிதைக்கின்றன என்பதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம்; கூடுதலாக, KAND ஆக்டின் இழைகளைப் பாதித்து செல் இறப்பைத் தூண்டுகிறது; இந்த பன்முக விளைவுகள், அறியப்பட்ட நுண்குழாய் தடுப்பான்களின் விளைவுகளிலிருந்து வேறுபடுகின்றன. மேலும், அர்சோனிக் அமிலத்திற்கான ஒரு புதிய செயல்முறையை இவை சுட்டிக்காட்டுகின்றன, இது புதிய களைக்கொல்லிகளின் உருவாக்கத்தில் ஒரு முக்கிய நன்மையாக அமைகிறது.
பயனுள்ள இயற்கைப் பொருட்கள் மற்றும் அவற்றின் வழிப்பொருட்களைக் கண்டறிந்து நடைமுறைப்படுத்துவது, மனித வாழ்க்கைத் தரத்தை மேம்படுத்துவதற்கான ஒரு வழியாகும். நுண்ணுயிரிகள், தாவரங்கள் மற்றும் பூச்சிகளால் உற்பத்தி செய்யப்படும் இரண்டாம் நிலை வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்கள், மருத்துவம் மற்றும் விவசாயத்தில் பெரும் முன்னேற்றங்களுக்கு வழிவகுத்துள்ளன. பல நுண்ணுயிர் எதிர்ப்பிகள் மற்றும் இரத்தப் புற்றுநோய் எதிர்ப்பு மருந்துகள் இயற்கைப் பொருட்களிலிருந்து உருவாக்கப்பட்டுள்ளன. மேலும், பல்வேறு வகையானபூச்சிக்கொல்லிகள்விவசாயப் பயன்பாட்டிற்காக, இந்த இயற்கை பொருட்களிலிருந்து பூஞ்சைக்கொல்லிகளும் களைக்கொல்லிகளும் பிரித்தெடுக்கப்படுகின்றன. குறிப்பாக, நவீன விவசாயத்தில் பயிர் விளைச்சலை அதிகரிப்பதற்கு களைக் கட்டுப்பாட்டுக் களைக்கொல்லிகள் முக்கியமான கருவிகளாகும், மேலும் பல்வேறு வகையான சேர்மங்கள் ஏற்கனவே வணிக ரீதியாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. தாவரங்களில் உள்ள ஒளிச்சேர்க்கை, அமினோ அமில வளர்சிதை மாற்றம், செல்சுவர் உருவாக்கம், செல் பிரிவு ஒழுங்குமுறை, தாவர ஹார்மோன் சமிக்ஞை அல்லது புரத உருவாக்கம் போன்ற பல செல் செயல்முறைகள் களைக்கொல்லிகளின் பொதுவான இலக்குகளாகக் கருதப்படுகின்றன. செல் பிரிவு ஒழுங்குமுறையைப் பாதிப்பதன் மூலம் தாவர வளர்ச்சியைப் பாதிக்கும் களைக்கொல்லிகளின் ஒரு பொதுவான வகை, நுண்குழாய் செயல்பாட்டைத் தடுக்கும் சேர்மங்களாகும்.
நுண்குழாய்கள் சைட்டோஸ்கெலட்டனின் கூறுகளாகும், மேலும் அவை யூகேரியோடிக் செல்களில் பரவலாகப் பாதுகாக்கப்படுகின்றன. டியூபுலின் ஹெட்டிரோடைமர், α-டியூபுலின் மற்றும் β-டியூபுலின் ஆகியவற்றைக் கொண்டு நேரியல் நுண்குழாய் புரோட்டோஃபிலமென்ட்களை உருவாக்குகிறது, இதில் 13 புரோட்டோஃபிலமென்ட்கள் ஒரு உருளை வடிவ அமைப்பை உருவாக்குகின்றன. தாவர செல்களில் நுண்குழாய்கள் செல் வடிவத்தைத் தீர்மானித்தல், செல் பிரிவு மற்றும் செல் உள் போக்குவரத்து உட்பட பல பணிகளைச் செய்கின்றன3,4. தாவர செல்கள் இடைநிலை பிளாஸ்மா சவ்வுக்குக் கீழே நுண்குழாய்களைக் கொண்டுள்ளன, மேலும் கார்டிகல் நுண்குழாய்கள் எனப்படும் இவை, செல்லுலோஸ் சின்தேஸ் வளாகங்களை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் செல்லுலோஸ் மைக்ரோஃபைப்ரில்களின் அமைப்பைக் கட்டுப்படுத்துவதாகக் கருதப்படுகிறது4,5. வேர் நுனியின் விரைவான நீட்சி மண்டலத்தில் உள்ள வேர் புறத்தோல் செல்களின் கார்டிகல் நுண்குழாய்கள் பக்கவாட்டில் அமைந்துள்ளன, மேலும் செல்லுலோஸ் மைக்ரோஃபைபர்கள் இந்த நுண்குழாய்களைப் பின்பற்றி செல் விரிவாக்கத்தின் திசையைக் கட்டுப்படுத்துகின்றன, இதன் மூலம் திசைசார்ந்த செல் நீட்சியை ஊக்குவிக்கின்றன. எனவே, நுண்குழாய்களின் செயல்பாடு தாவர உருவவியலுடன் நெருங்கிய தொடர்புடையது. டியூபுலினைக் குறியீடு செய்யும் மரபணுக்களில் ஏற்படும் அமினோ அமில மாற்றீடுகள், அரபிடாப்சிஸ் தாவரத்தின் புறணி நுண்குழாய் வரிசைகளில் சாய்வையும், இடது அல்லது வலது பக்க வளர்ச்சியையும் ஏற்படுத்துகின்றன 6,7. இதேபோல், நுண்குழாய் இயக்கவியலைக் கட்டுப்படுத்தும் நுண்குழாய்-தொடர்புடைய புரதங்களில் ஏற்படும் சடுதிமாற்றங்களும் சிதைந்த வேர் வளர்ச்சிக்கு வழிவகுக்கும்8,9,10,11,12,13. மேலும், பிரெட்டிலாக்ளோர் என்றும் அழைக்கப்படும் டைசோபிரமைடு போன்ற நுண்குழாய்களைச் சிதைக்கும் களைக்கொல்லிகளைக் கொண்டு செய்யப்படும் சிகிச்சையும் இடது பக்க சாய்வான வேர் வளர்ச்சியை ஏற்படுத்துகிறது14. தாவர வளர்ச்சியின் திசையைத் தீர்மானிப்பதில் நுண்குழாய் செயல்பாட்டின் துல்லியமான கட்டுப்பாடு இன்றியமையாதது என்பதை இந்தத் தரவுகள் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
பல்வேறு வகையான நுண்குழாய் தடுப்பான்கள் கண்டறியப்பட்டுள்ளன, மேலும் இந்த மருந்துகள் உயிரணு எலும்புக்கூடு ஆராய்ச்சிக்கும், வேளாண்மை மற்றும் மருத்துவத் துறைகளுக்கும் குறிப்பிடத்தக்க பங்களிப்புகளைச் செய்துள்ளன². குறிப்பாக, ஒரைசாலின், டைநைட்ரோஅனிலின் சேர்மங்கள், டைசோபிரமைடு, பென்சமைடு தொடர்பான சேர்மங்கள் மற்றும் அவற்றின் ஒப்புருக்கள் நுண்குழாய்களின் செயல்பாட்டைத் தடுத்து, அதன் மூலம் தாவர வளர்ச்சியையும் தடுக்கின்றன. எனவே, அவை களைக்கொல்லிகளாகப் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. இருப்பினும், நுண்குழாய்கள் தாவர மற்றும் விலங்கு செல்களின் ஒரு முக்கிய அங்கமாக இருப்பதால், பெரும்பாலான நுண்குழாய் தடுப்பான்கள் இவ்விரு வகை செல்களுக்கும் நச்சுத்தன்மை வாய்ந்தவையாக உள்ளன. எனவே, களைக்கொல்லிகளாக அவற்றின் அங்கீகரிக்கப்பட்ட பயன்பாடு இருந்தபோதிலும், குறைந்த எண்ணிக்கையிலான நுண்குழாய் எதிர்ப்பு முகவர்களே நடைமுறை நோக்கங்களுக்காகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
ஸ்ட்ரெப்டோமைசஸ் என்பது ஸ்ட்ரெப்டோமைசஸ் குடும்பத்தைச் சேர்ந்த ஒரு பேரினம் ஆகும். இதில் காற்றில் வாழும், கிராம்-பாசிட்டிவ், இழை வடிவ பாக்டீரியாக்கள் அடங்கும். இது பரந்த அளவிலான இரண்டாம் நிலை வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களை உற்பத்தி செய்யும் திறனுக்காகப் பரவலாக அறியப்படுகிறது. எனவே, இது புதிய உயிரியல் ரீதியாகச் செயல்படும் இயற்கை பொருட்களின் மிக முக்கியமான ஆதாரங்களில் ஒன்றாகக் கருதப்படுகிறது. தற்போதைய ஆய்வில், ஸ்ட்ரெப்டோமைசஸ் வெர்ரென்சிஸ் MK493-CF1 மற்றும் S. வெர்ரென்சிஸ் ISP 5486 ஆகியவற்றிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட கௌமோனமைடு என்ற புதிய சேர்மத்தை நாங்கள் கண்டுபிடித்தோம். நிறமாலை பகுப்பாய்வு மற்றும் முழு நிறமாலை பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி, கௌமோனமைடின் அமைப்பு வகைப்படுத்தப்பட்டு, அதன் தனித்துவமான N-ஆல்காக்ஸிபைரோல் எலும்புக்கூடு தீர்மானிக்கப்பட்டது. உர்ஸ்மோனமைடு மற்றும் அதன் வழிப்பொருட்களின் ஒரு செயற்கை இடைநிலையான உர்ஸ்மோனிக் அமிலம், பிரபலமான மாதிரித் தாவரமான அரபிடோப்சிஸ் தாலியானாவின் வளர்ச்சி மற்றும் முளைத்தலைத் தடுப்பதாகக் கண்டறியப்பட்டது. அமைப்பு-செயல்பாட்டுத் தொடர்பு ஆய்வில், அர்சோனிக் அமிலமாக C9 மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஒரு சேர்மம், அதாவது அர்சோனிக் அமிலத்தின் நோனிலாக்ஸி வழித்தோன்றல் (KAND), வளர்ச்சி மற்றும் முளைத்தல் மீதான தடுப்பு விளைவை குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரிக்கிறது என்பதைக் கண்டறிந்தோம். குறிப்பாக, புதிதாகக் கண்டுபிடிக்கப்பட்ட இந்தத் தாவர வளர்ச்சித் தடுப்பான், புகையிலை மற்றும் ஈரல்பாசி ஆகியவற்றின் வளர்ச்சியையும் பாதித்ததுடன், பாக்டீரியா அல்லது ஹீலா செல்களுக்கு நச்சுத்தன்மையற்றதாகவும் இருந்தது. மேலும், சில அர்மோடோனிக் அமில வழித்தோன்றல்கள் சிதைந்த வேர்ப் புறத்தோற்றத்தைத் தூண்டுகின்றன, இது இந்த வழித்தோன்றல்கள் நேரடியாகவோ அல்லது மறைமுகமாகவோ நுண்குழாய்களைப் பாதிக்கின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்தக் கருத்துக்கு இணங்க, இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிக்கல் முறையிலோ அல்லது ஒளிரும் புரதங்களாலோ குறியிடப்பட்ட நுண்குழாய்கள் குறித்த எங்கள் அவதானிப்புகள், KAND சிகிச்சையானது நுண்குழாய்களை சிதைக்கிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன. கூடுதலாக, குமாமோடோனிக் அமில வழித்தோன்றல்களுடனான சிகிச்சையானது ஆக்டின் நுண் இழைகளைச் சிதைத்தது. இவ்வாறு, சைட்டோஸ்கெலட்டனை அழிப்பதை உள்ளடக்கிய தனித்துவமான செயல்முறையைக் கொண்ட ஒரு புதிய தாவர வளர்ச்சித் தடுப்பானை நாங்கள் கண்டுபிடித்துள்ளோம்.
MK493-CF1 திரிபு டோக்கியோவின் ஷினாகவா-குவில் உள்ள மண்ணிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. MK493-CF1 திரிபு நன்கு கிளைத்த ஸ்ட்ரோமல் மைசீலியத்தை உருவாக்கியது. 16S ரிபோசோமல் ஆர்.என்.ஏ மரபணுவின் (1422 bp) பகுதி வரிசை தீர்மானிக்கப்பட்டது. இந்த திரிபு S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: வழக்கமான திரிபு, 99.93%) உடன் மிகவும் ஒத்திருக்கிறது. இந்த முடிவின் அடிப்படையில், இந்த திரிபு S. werraensis-இன் வகை திரிபுடன் நெருங்கிய தொடர்புடையது என்று தீர்மானிக்கப்பட்டது. எனவே, இந்த திரிபுக்கு நாங்கள் தற்காலிகமாக S. werraensis MK493-CF1 என்று பெயரிட்டோம். S. werraensis ISP 5486T-ம் அதே உயிரியல் செயல்பாட்டுக் கலவைகளை உற்பத்தி செய்கிறது. இந்த நுண்ணுயிரியிலிருந்து இயற்கை பொருட்களைப் பெறுவது குறித்து ஆரம்பத்தில் ஆராய்ச்சி குறைவாக இருந்ததால், மேலும் வேதியியல் ஆராய்ச்சி மேற்கொள்ளப்பட்டது. S. werraensis MK493-CF1 ஐ 30°C வெப்பநிலையில் 14 நாட்களுக்கு திட நிலை நொதித்தல் மூலம் பார்லி ஊடகத்தில் வளர்த்த பிறகு, அந்த ஊடகம் 50% EtOH உடன் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. 59.5 மி.கி கச்சா சாற்றைப் பெறுவதற்காக 60 மி.லி மாதிரி உலர்த்தப்பட்டது. அந்தக் கச்சா சாறு, தலைகீழ் கட்ட HPLCக்கு உட்படுத்தப்பட்டு N-மெத்தாக்ஸி-1H-பைரோல்-2-கார்பாக்சமைடு (1, குமாமோனமைடு எனப் பெயரிடப்பட்டது, 36.0 மி.கி) பெறப்பட்டது. 1 இன் மொத்த அளவு கச்சா சாற்றின் சுமார் 60% ஆகும். எனவே, குமாமோனமைடு 1 இன் பண்புகளை விரிவாக ஆய்வு செய்ய நாங்கள் முடிவு செய்தோம்.
கௌமமோனமைடு 1 ஒரு வெண்மையான உருவமற்ற தூள் ஆகும், மேலும் உயர் தெளிவுத்திறன் நிறை நிறமாலையியல் (HRESIMS) C6H8N2O2 என்பதை உறுதிப்படுத்துகிறது (படம் 1). இந்த சேர்மத்தின் C2-இல் பதிலீடு செய்யப்பட்ட பைரோல் பகுதி δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR நிறமாலையில் δH: 4.5 Hz, H-5) மற்றும் δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ஆகியவற்றால் வகைப்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் 13C NMR நிறமாலை நான்கு sp2 கார்பன் அணுக்கள் இருப்பதைக் காட்டுகிறது. C2 நிலையில் ஒரு அமைடு குழு இருப்பது, C-3 புரோட்டானிலிருந்து δC 161.1-இல் உள்ள அமைடு கார்பனைல் கார்பனுக்கான HMBC தொடர்பு மூலம் மதிப்பிடப்பட்டது. மேலும், δH 4.10 (3H, S) மற்றும் δC 68.3 இல் உள்ள 1H மற்றும் 13C NMR சிகரங்கள், மூலக்கூறில் N-மெத்தாக்ஸி குழுக்கள் இருப்பதைக் குறிக்கின்றன. மேம்படுத்தப்பட்ட வேறுபாட்டு நிறமாலையியல் மற்றும் அணுக்கரு ஓவர்ஹவுசர் சுருக்கம் (NOEDF) போன்ற நிறமாலையியல் பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி மெத்தாக்ஸி குழுவின் சரியான நிலை இன்னும் தீர்மானிக்கப்படவில்லை என்றாலும், N-மெத்தாக்ஸி-1H-பைரோல்-2-கார்பாக்சமைடு முதல் சாத்தியமான சேர்மமாக ஆனது.
1-இன் சரியான கட்டமைப்பைத் தீர்மானிக்க, ஒரு முழுமையான தொகுப்பு செய்யப்பட்டது (படம் 2a). வணிகரீதியாகக் கிடைக்கும் 2-அமினோபைரிடின் 2-ஐ m-CPBA உடன் வினைபுரியச் செய்ததில், அதனுடன் தொடர்புடைய N-ஆக்சைடு 3 முழுமையான விளைச்சலில் கிடைத்தது. 2-இன் 2-அமினோஅசிடேஷனுக்குப் பிறகு, அப்ரமோவிச் விவரித்த வளைய ஒடுக்க வினையானது பென்சீனில் 90°C-இல் நிகழ்த்தப்பட்டு, விரும்பிய 1-ஹைட்ராக்ஸி-1H-பைரோல்-2-கார்போனிட்ரைல் 5 கிராம் அளவில் பெறப்பட்டது. வேகம் 60% (இரண்டு நிலைகள்). 15,16. பின்னர் 4-இன் மெத்திலேற்றம் மற்றும் நீராற்பகுப்பு, 1-மெத்தாக்ஸி-1H-பைரோல்-2-கார்பாக்சிலிக் அமிலத்தை ("குமடோனிக் அமிலம்" என அழைக்கப்படுகிறது, 6) நல்ல விளைச்சலில் (70%, இரண்டு படிகள்) அளித்தது. இறுதியாக, அமில குளோரைடு இடைநிலை 6 வழியாக நீர்த்த அம்மோனியாவைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்ட அமினேற்றம், குமமோட்டோ அமைடு 1-ஐ 98% விளைச்சலில் அளித்தது. தொகுக்கப்பட்ட 1-இன் அனைத்து நிறமாலைத் தரவுகளும் பிரித்தெடுக்கப்பட்ட 1-ஐப் போலவே இருந்தன, எனவே 1-இன் அமைப்பு தீர்மானிக்கப்பட்டது;
அர்பெனமைடு மற்றும் அர்பெனிக் அமிலத்தின் உயிரியல் செயல்பாட்டின் பொதுவான தொகுப்பு மற்றும் பகுப்பாய்வு. (அ) குமாமோட்டோ அமைடின் முழுமையான தொகுப்பு. (ஆ) ஏழு நாள் வயதுடைய இயல்புவகை அரபிடாப்சிஸ் கொலம்பியா (Col) நாற்றுகள், குறிப்பிடப்பட்ட செறிவுகளில் கூமமோனாமைடு 6 அல்லது கூமமோனாமைடு 1-ஐக் கொண்ட முராஷிகே மற்றும் ஸ்கூக் (MS) தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்டன. அளவுப் பட்டை = 1 செ.மீ.
முதலில், தாவர வளர்ச்சியை நெறிப்படுத்தும் திறனுக்காக, அர்பெனமைடு மற்றும் அதன் இடைநிலைகளின் உயிரியல் செயல்பாடுகளை நாங்கள் மதிப்பிட்டோம். MS அகார் ஊடகத்தில் அர்ஸ்மோனாமைடு 1 அல்லது அர்ஸ்மோனிக் அமிலம் 6-இன் பல்வேறு செறிவுகளைச் சேர்த்து, இந்த ஊடகத்தில் அரபிடாப்சிஸ் தாலியானா நாற்றுகளை வளர்த்தோம். இந்தச் சோதனைகள், 6-இன் அதிக செறிவுகள் (500 μM) வேர் வளர்ச்சியைத் தடுத்ததைக் காட்டின (படம் 2b). அடுத்து, 6-இன் N1 நிலையில் பதிலீடு செய்வதன் மூலம் பல்வேறு வழிப்பொருட்களை உருவாக்கி, அவற்றின் மீது அமைப்பு-செயல்பாட்டுத் தொடர்பு ஆய்வுகளை மேற்கொண்டோம் (ஒப்புமைத் தொகுப்பு செயல்முறை துணைத் தகவலில் (SI) விவரிக்கப்பட்டுள்ளது). 50 μM அர்ஸ்மோனிக் அமில வழிப்பொருட்களைக் கொண்ட ஒரு ஊடகத்தில் அரபிடாப்சிஸ் நாற்றுகள் வளர்க்கப்பட்டு, படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி வேரின் நீளம் அளவிடப்பட்டது. படங்கள் 3a, b, மற்றும் S1-இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, கௌமாமோ அமிலங்கள் N1 நிலையில் வெவ்வேறு நீளமுள்ள நேரியல் ஆல்காக்ஸி சங்கிலிகளையோ (9, 10, 11, 12, மற்றும் 13) அல்லது பெரிய ஆல்காக்ஸி சங்கிலிகளையோ (15, 16, மற்றும் 17) கொண்டுள்ளன. இந்த வழிப்பொருட்கள் வேர் வளர்ச்சியை குறிப்பிடத்தக்க அளவில் தடுத்தன. மேலும், 200 μM 10, 11, அல்லது 17-ஐப் பயன்படுத்துவது முளைத்தலைத் தடுத்ததை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படங்கள் 3c மற்றும் S2).
குமாமோட்டோ அமைடு மற்றும் தொடர்புடைய சேர்மங்களின் அமைப்பு-செயல்பாட்டு உறவு பற்றிய ஆய்வு. (அ) ஒப்புருக்களின் அமைப்பு மற்றும் தொகுப்புத் திட்டம். (ஆ) 50 μM கூமோனாமைடு வழிப்பொருட்களுடன் அல்லது அது இல்லாமல் MS ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்ட 7-நாள் வயது நாற்றுகளின் வேர் நீளத்தின் அளவு நிர்ணயம். நட்சத்திரக் குறிகள் போலி சிகிச்சையுடனான குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (t சோதனை, p < 0.05).< 0.05). n>18. தரவுகள் சராசரி ± திட்ட விலக்கமாகக் காட்டப்பட்டுள்ளன. 50%-க்கும் மேற்பட்ட விதைகள் முளைக்காததால், nt என்பது “சோதிக்கப்படவில்லை” என்பதைக் குறிக்கிறது. (c) 200 μM கூமோனமைடு மற்றும் தொடர்புடைய சேர்மங்களுடன் அல்லது அவை இல்லாமல், MS ஊடகத்தில் 7 நாட்கள் அடைகாக்கப்பட்ட, பதப்படுத்தப்பட்ட விதைகளின் முளைப்பு வீதத்தின் அளவு நிர்ணயம். நட்சத்திரக் குறிகள் போலி சிகிச்சையுடனான குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (கை-வர்க்க சோதனை). n=96.
சுவாரஸ்யமாக, C9-ஐ விட நீளமான ஆல்கைல் பக்கச் சங்கிலிகளைச் சேர்ப்பது தடுப்புச் செயல்பாட்டைக் குறைத்தது. இது, குமாமோட்டோயிக் அமிலம் தொடர்பான சேர்மங்கள் தங்களின் உயிரியல் செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்த ஒரு குறிப்பிட்ட அளவுள்ள பக்கச் சங்கிலிகள் தேவை என்பதை உணர்த்துகிறது.
கட்டமைப்பு-செயல்பாட்டு உறவுப் பகுப்பாய்வில், C9 ஆனது அர்சோனிக் அமிலமாக மாற்றியமைக்கப்பட்டதும், அர்சோனிக் அமிலத்தின் நோனிலாக்ஸி வழித்தோன்றலே (இனி KAND 11 எனக் குறிப்பிடப்படும்) மிகவும் செயல்திறன் மிக்க தாவர வளர்ச்சித் தடுப்பானாக இருந்ததும் தெரியவந்ததால், நாங்கள் KAND 11-இன் மேலும் விரிவான பண்புக்கூறு ஆய்வை மேற்கொண்டோம். அரபிடாப்சிஸ் தாவரத்திற்கு 50 μM KAND 11 கொண்டு சிகிச்சை அளித்தபோது, ​​முளைத்தல் ஏறக்குறைய முழுமையாகத் தடுக்கப்பட்டது. ஆனால், KAND 11-இன் குறைந்த செறிவுகள் (40, 30, 20, அல்லது 10 μM) அளவைப் பொறுத்து வேர் வளர்ச்சியைத் தடுத்தன (படம் 4a, b). KAND 11 வேர் மெரிஸ்டெம் உயிர்வாழ்திறனைப் பாதிக்கிறதா என்பதைச் சோதிக்க, புரோபிடியம் அயோடைடு (PI) கொண்டு சாயமேற்றப்பட்ட வேர் மெரிஸ்டெம்களை நாங்கள் ஆய்வுசெய்து, மெரிஸ்டெம் பரப்பளவின் அளவை அளந்தோம். 25 μM KAND-11 கொண்ட ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்ட நாற்றுகளின் மெரிஸ்டத்தின் அளவு 151.1 ± 32.5 μm ஆக இருந்தது, அதே சமயம் DMSO கொண்ட கட்டுப்பாட்டு ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்ட நாற்றுகளின் மெரிஸ்டத்தின் அளவு 264.7 ± 30.8 μm ஆக இருந்தது (படம் 4c, d), இது KAND-11 செல் செயல்பாட்டை மீட்டெடுக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. பரவுதல். வேர் மெரிஸ்டம். இதற்கு இணங்க, KAND 11 சிகிச்சையானது வேர் மெரிஸ்டத்தில் செல் பிரிவு குறிப்பானான CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS சமிக்ஞையின் அளவைக் குறைத்தது (படம் 4e) 17. இந்த முடிவுகள், KAND 11 செல் பெருக்கச் செயல்பாட்டைக் குறைப்பதன் மூலம் வேர் வளர்ச்சியைத் தடுக்கிறது என்பதைக் காட்டுகின்றன.
அர்பீனானிக் அமில வழிப்பொருட்களின் (அர்பீனிலாக்ஸி வழிப்பொருட்கள்) வளர்ச்சி மீதான தடுப்பு விளைவின் பகுப்பாய்வு. (அ) குறிப்பிடப்பட்ட KAND 11 செறிவுகளுடன் MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்ட 7-நாள் வயதுடைய இயல்புவகை Col நாற்றுகள். அளவுப் பட்டை = 1 செ.மீ. (ஆ) வேர் நீளத்தின் அளவு நிர்ணயம். எழுத்துக்கள் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (டூக்கி HSD சோதனை, p < 0.05).< 0.05). n>16. தரவுகள் சராசரி ± திட்ட விலக்கமாகக் காட்டப்பட்டுள்ளன. (c) 25 μM KAND 11 உடன் அல்லது அது இல்லாமல் MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்ட, புரோபிடியம் அயோடைடு சாயமேற்றப்பட்ட இயல்புவகை Col வேர்களின் கான்கோகல் நுண்ணோக்கிப் படம். வெள்ளை அடைப்புக்குறிகள் வேர் மெரிஸ்டத்தைக் குறிக்கின்றன. அளவுப் பட்டை = 100 µm. (d) வேர் மெரிஸ்டம் அளவின் அளவு நிர்ணயம் (n = 10 முதல் 11 வரை). புள்ளிவிவர வேறுபாடுகள் t-சோதனையைப் பயன்படுத்தித் தீர்மானிக்கப்பட்டன (p > 0.05).< 0.05). பட்டைகள் சராசரி மெரிஸ்டம் அளவைக் குறிக்கின்றன. (இ) CDKB2 கட்டமைப்பைக் கொண்ட ஒரு வேர் மெரிஸ்டத்தின் வேறுபட்ட குறுக்கீட்டு மாறுபாடு (DIC) நுண்ணோக்கிப் படம்; 1pro: CDKB2; 1-GUS சாயமேற்றப்பட்டது மற்றும் 25 µM KAND சோதனையுடன் அல்லது அது இல்லாமல் MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்ட 5-நாள் வயது நாற்றுகளில் சாயமேற்றப்பட்டது.
KAND 11-இன் தாவர நச்சுத்தன்மை, மற்றொரு இருவித்திலைத் தாவரமான புகையிலை (Nicotiana tabacum) மற்றும் ஒரு முக்கிய நிலத் தாவர மாதிரி உயிரினமான ஈரல்பாசி (Marchantia polymorpha) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி மேலும் சோதிக்கப்பட்டது. அரபிடாப்சிஸைப் போலவே, 25 μM KAND 11 கொண்ட ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்ட புகையிலை SR-1 நாற்றுகள் குட்டையான வேர்களை உருவாக்கின (படம் 5a). கூடுதலாக, 200 μM KAND 11 கொண்ட தட்டுகளில் 48 விதைகளில் 40 முளைத்தன, அதேசமயம் போலியாகச் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட ஊடகங்களில் அனைத்து 48 விதைகளும் முளைத்தன. இது KAND-இன் அதிக செறிவுகள் குறிப்பிடத்தக்கவை என்பதைக் குறிக்கிறது (p < 0.05).< 0.05; கை சோதனை - வர்க்கம்) புகையிலையின் முளைத்தலைத் தடுத்தது. (படம் 5b). கூடுதலாக, லிவர்வார்ட்டில் பாக்டீரியா வளர்ச்சியைத் தடுத்த KAND 11-இன் செறிவு, அரபிடாப்சிஸில் உள்ள பயனுள்ள செறிவைப் போலவே இருந்தது (படம் 5c). இந்த முடிவுகள், KAND 11 பல்வேறு தாவரங்களின் வளர்ச்சியைத் தடுக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகின்றன. பின்னர், உயர் விலங்கு மற்றும் பாக்டீரியா செல்களின் பிரதிநிதிகளாக முறையே மனித ஹீலா செல்கள் மற்றும் எஸ்செரிச்சியா கோலி DH5α திரிபு போன்ற பிற உயிரினங்களில், கரடி மோனோஅமைடு தொடர்பான சேர்மங்களின் சாத்தியமான செல்நச்சுத்தன்மையை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். தொடர்ச்சியான செல் பெருக்கச் சோதனைகளில், 100 μM செறிவுகளில் கௌமோனமைடு 1, கௌமோனமிடிக் அமிலம் 6 மற்றும் KAND 11 ஆகியவை ஹீலா அல்லது ஈ. கோலி செல்களின் வளர்ச்சியைப் பாதிக்கவில்லை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 5d,e).
அரபிடாப்சிஸ் அல்லாத உயிரினங்களில் KAND 11-இன் வளர்ச்சித் தடுப்பு. (அ) இரண்டு வார வயதுடைய இயல்புவகை SR-1 புகையிலை நாற்றுகள், 25 μM KAND 11 கொண்ட செங்குத்தாக வைக்கப்பட்ட MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்டன. (ஆ) இரண்டு வார வயதுடைய இயல்புவகை SR-1 புகையிலை நாற்றுகள், 200 μM KAND 11 கொண்ட கிடைமட்டமாக வைக்கப்பட்ட MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்டன. (இ) இரண்டு வார வயதுடைய இயல்புவகை Tak-1 ஈரல்பாசி மொட்டுகள், குறிப்பிடப்பட்ட KAND 11 செறிவுகளுடன் கூடிய காம்போர்க் B5 தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்டன. இரண்டு வார அடைகாக்கும் காலத்திற்குள் வளர்ச்சியை நிறுத்திய வித்துக்களை சிவப்பு அம்புக்குறிகள் குறிக்கின்றன. (ஈ) ஹீலா செல்களின் செல் பெருக்கச் சோதனை. உயிருள்ள செல்களின் எண்ணிக்கை, செல் எண்ணிக்கை கருவித்தொகுப்பு 8 (டோஜிண்டோ) பயன்படுத்தி நிலையான நேர இடைவெளிகளில் அளவிடப்பட்டது. ஒரு கட்டுப்பாடாக, ஹீலா செல்களுக்கு 5 μg/ml ஆக்டினோமைசின் D (Act D) கொண்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது, இது RNA பாலிமரேஸ் படியெடுத்தலைத் தடுத்து செல் இறப்பை ஏற்படுத்துகிறது. பகுப்பாய்வுகள் மும்முறை செய்யப்பட்டன. (இ) ஈ. கோலை செல் பெருக்கச் சோதனை. OD600-ஐ அளவிடுவதன் மூலம் ஈ. கோலையின் வளர்ச்சி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. ஒரு கட்டுப்பாடாக, பாக்டீரியாவின் செல்சுவர் தொகுப்பைத் தடுக்கும் 50 μg/ml ஆம்பிசிலின் (Amp) கொண்டு செல்களுக்கு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது. பகுப்பாய்வுகள் மும்முறை செய்யப்பட்டன.
யுராமைடு தொடர்பான சேர்மங்களால் ஏற்படும் செல்நச்சுத்தன்மையின் செயல்பாட்டு வழிமுறையைப் புரிந்துகொள்வதற்காக, மிதமான தடுப்பு விளைவுகளைக் கொண்ட அர்பெனிக் அமில வழிப்பொருட்களை நாங்கள் மீண்டும் பகுப்பாய்வு செய்தோம். படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, படங்கள் 2b, 6a-வில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, அதிக செறிவுகளில் (200 μM) உர்மோடோனிக் அமிலம் 6 கொண்ட அகார் தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்ட நாற்றுகள் குட்டையான மற்றும் இடதுபுறம் வளைந்த வேர்களை (θ = – 23.7 ± 6.1) உருவாக்கின, அதேசமயம் கட்டுப்பாட்டு ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்ட நாற்றுகள் ஏறக்குறைய நேரான வேர்களை (θ = – 3.8 ± 7.1) உருவாக்கின. இந்த சிறப்பியல்பு சாய்வான வளர்ச்சியானது புறணி நுண்குழாய்களின் செயலிழப்பால் ஏற்படுவதாக அறியப்படுகிறது¹⁴,¹⁸. இந்தக் கண்டுபிடிப்புடன் ஒத்துப்போகும் வகையில், நுண்குழாய்களை நிலை குலையச் செய்யும் மருந்துகளான டைசோபிரமைடு மற்றும் ஒரைசாலின் ஆகியவை எங்கள் வளர்ச்சி நிலைகளில் இதேபோன்ற வேர் சாய்வைத் தூண்டின (படங்கள் 2b, 6a). அதே நேரத்தில், நாங்கள் உர்மோடோனிக் அமில வழிப்பொருட்களைச் சோதித்து, குறிப்பிட்ட செறிவுகளில் சாய்வான வேர் வளர்ச்சியைத் தூண்டிய அவற்றில் சிலவற்றைத் தேர்ந்தெடுத்தோம். சேர்மங்கள் 8, 9, மற்றும் 15 ஆகியவை முறையே 75 μM, 50 μM, மற்றும் 40 μM செறிவுகளில் வேர் வளர்ச்சியின் திசையை மாற்றின, இது இந்த சேர்மங்கள் நுண்குழாய்களை திறம்பட நிலை குலையச் செய்ய முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது (படம் 2b, 6a). நாங்கள் மிகவும் சக்திவாய்ந்த அர்சோலிக் அமில வழிப்பொருளான KAND 11-ஐ குறைந்த செறிவில் (15 µM) சோதித்தோம், மேலும் KAND 11-ஐப் பயன்படுத்துவது வேர் வளர்ச்சியைத் தடுத்தது என்பதையும், வேர்கள் இடதுபுறமாகச் சாய்வதற்குப் போக்காக இருந்தாலும், வேர் வளர்ச்சியின் திசை சீரற்றதாக இருந்தது என்பதையும் கண்டறிந்தோம் (படம் C3). நுண்குழாய்களை நிலை குலையச் செய்யும் மருந்துகளின் அதிக செறிவுகள் சில சமயங்களில் வேர் சாய்வை ஏற்படுத்துவதற்குப் பதிலாக தாவர வளர்ச்சியைத் தடுப்பதால், வேர் புறத்தோல் செல்களில் உள்ள புறணி நுண்குழாய்களைக் கவனிப்பதன் மூலம் KAND 11 நுண்குழாய்களைப் பாதிக்கிறதா என்ற சாத்தியக்கூறை நாங்கள் பின்னர் மதிப்பிட்டோம். 25 μM KAND 11 கொண்டு சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட நாற்று வேர்களின் புறத்தோல் செல்களில், β-டியூபுலின் எதிர்ப்புப் பொருள்களைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்ட இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிஸ்ட்ரி ஆய்வில், நீட்சி மண்டலத்தில் உள்ள புறத்தோல் செல்களில் கிட்டத்தட்ட அனைத்து புறணி நுண்குழாய்களும் மறைந்திருந்தது (படம் 6b). இந்த முடிவுகள், குமாமோட்டோனிக் அமிலமும் அதன் வழிப்பொருள்களும் நுண்குழாய்களின் மீது நேரடியாகவோ அல்லது மறைமுகமாகவோ செயல்பட்டு அவற்றைச் சிதைக்கின்றன என்பதையும், இந்தச் சேர்மங்கள் புதிய நுண்குழாய் தடுப்பான்கள் என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
அர்சோனிக் அமிலம் மற்றும் அதன் வழிப்பொருட்கள் அரபிடாப்சிஸ் தாலியானாவில் உள்ள புறணி நுண்குழாய்களை மாற்றியமைக்கின்றன. (அ) குறிப்பிட்ட செறிவுகளில் பல்வேறு அர்மோடோனிக் அமில வழிப்பொருட்களின் முன்னிலையில் அளவிடப்பட்ட வேர் சாய்வுக் கோணம். நுண்குழாய்களைத் தடுப்பதாக அறியப்பட்ட இரண்டு சேர்மங்களான டைசோபிரமைடு மற்றும் ஒரைசாலின் ஆகியவற்றின் விளைவுகளும் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. உள்ளிணைப்புப் படம், வேர் வளர்ச்சிக் கோணத்தை அளவிடப் பயன்படுத்தப்படும் தரநிலையைக் காட்டுகிறது. நட்சத்திரக் குறிகள் போலி சிகிச்சையுடனான குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (t சோதனை, p < 0.05).< 0.05). n>19. அளவுகோல் = 1 செ.மீ. (b) நீட்சி மண்டலத்தில் உள்ள புறத்தோல் செல்களில் உள்ள புறணி நுண்குழாய்கள். 25 μM KAND 11 உடன் அல்லது அது இல்லாமல் MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்ட இயல்புவகை அரபிடாப்சிஸ் கோல் வேர்களில் உள்ள நுண்குழாய்கள், β-டியூபுலின் முதன்மை எதிர்ப்பான்கள் மற்றும் அலெக்ஸா ஃப்ளூர்-இணைக்கப்பட்ட இரண்டாம் நிலை எதிர்ப்பான்களைப் பயன்படுத்தி நோயெதிர்ப்பு வேதியியல் சாயமேற்றல் மூலம் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. அளவுகோல் = 10 µm. (c) வேர் மெரிஸ்டத்தில் உள்ள நுண்குழாய்களின் மைட்டாசிஸ் அமைப்பு. நுண்குழாய்கள் நோயெதிர்ப்பு வேதியியல் சாயமேற்றல் மூலம் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. புரோஃபேஸ் மண்டலங்கள், ஸ்பிண்டில்கள் மற்றும் ஃபிராக்மோபிளாஸ்ட்கள் உள்ளிட்ட மைட்டாசிஸ் அமைப்புகள், கான்ஃபோகல் படங்களிலிருந்து எண்ணப்பட்டன. அம்புக்குறிகள் மைட்டாசிஸ் நுண்குழாய் அமைப்புகளைக் குறிக்கின்றன. நட்சத்திரக் குறிகள் போலி சிகிச்சையுடன் உள்ள குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (t சோதனை, p < 0.05).< 0.05). n>9. அளவுகோல் பட்டை = 50 µm.
உர்சா நுண்குழாய் செயல்பாட்டை சீர்குலைக்கும் திறனைக் கொண்டிருந்தாலும், அதன் செயல்பாட்டு முறை வழக்கமான நுண்குழாய் சிதைக்கும் காரணிகளிலிருந்து வேறுபட்டதாக இருக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது. எடுத்துக்காட்டாக, டைசோபிரமைடு மற்றும் ஒரைசாலின் போன்ற நுண்குழாய் சிதைக்கும் காரணிகளின் அதிக செறிவுகள் புறத்தோல் செல்களின் திசைசார்ந்த விரிவாக்கத்தைத் தூண்டுகின்றன, ஆனால் KAND 11 அவ்வாறு செய்வதில்லை. மேலும், KAND 11 மற்றும் டைசோபிரமைடு ஆகியவற்றை ஒன்றாகப் பயன்படுத்தியபோது, ​​டைசோபிரமைடால் தூண்டப்பட்ட வேர் வளர்ச்சிப் பிரதிபலிப்பும், KAND 11-ஆல் தூண்டப்பட்ட வளர்ச்சித் தடையும் ஒருங்கே காணப்பட்டன (படம் S4). KAND 11-க்கு அதிஉணர்திறன் கொண்ட டைசோபிரமைடு 1-1 (phs1-1) சடுதிமாற்றியின் பிரதிபலிப்பையும் நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். phs1-1 ஒரு மரபுசாரா டியூபுலின் கைனேஸ் புள்ளிப் பிறழ்வைக் கொண்டுள்ளது மற்றும் டைசோபிரமைடு9,20 கொண்டு சிகிச்சையளிக்கும்போது குட்டையான வேர்களை உருவாக்குகிறது. KAND 11 கொண்ட அகார் ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்ட phs1-1 சடுதிமாற்றி நாற்றுகள், டைசோபிரமைடில் வளர்க்கப்பட்ட நாற்றுகளைப் போலவே குட்டையான வேர்களைக் கொண்டிருந்தன (படம் S5).
மேலும், KAND 11 கொண்டு சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட நாற்றுகளின் வேர் மெரிஸ்டத்தில், புரோஃபேஸ் மண்டலங்கள், ஸ்பிண்டில்கள் மற்றும் ஃபிராக்மோபிளாஸ்ட்கள் போன்ற மைட்டாடிக் மைக்ரோடியூபில் கட்டமைப்புகளை நாங்கள் கண்டறிந்தோம். CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-க்கான அவதானிப்புகளுக்கு இணங்க, மைட்டாடிக் மைக்ரோடியூபில்களின் எண்ணிக்கையில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவு காணப்பட்டது (படம் .6c).
KAND 11-இன் செல் நச்சுத்தன்மையை துணை செல் மட்டத்தில் வகைப்படுத்த, நாங்கள் புகையிலை BY-2 சஸ்பென்ஷன் செல்களுக்கு KAND 11-ஐக் கொண்டு சிகிச்சை அளித்து, அவற்றின் எதிர்வினையைக் கவனித்தோம். கார்டிகல் மைக்ரோடியூபில்களில் KAND 11-இன் விளைவை மதிப்பிடுவதற்காக, மைக்ரோடியூபில்களை ஒளிரும் வகையில் குறியிடும் TagRFP-TUA6-ஐ வெளிப்படுத்தும் BY-2 செல்களில் நாங்கள் முதலில் KAND 11-ஐச் சேர்த்தோம். சைட்டோபிளாஸ்மிக் பிக்சல்களுக்கு மத்தியில் சைட்டோஸ்கெலெட்டல் பிக்சல்களின் சதவீதத்தை அளவிடும் படப் பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி கார்டிகல் மைக்ரோடியூபில் அடர்த்தி மதிப்பிடப்பட்டது. 50 μM அல்லது 100 μM KAND 11-ஐக் கொண்டு 1 மணி நேரம் சிகிச்சை அளித்த பிறகு, அடர்த்தி முறையே 0.94 ± 0.74% அல்லது 0.23 ± 0.28% ஆகக் கணிசமாகக் குறைந்தது என்றும், அதே சமயம் DMSO-வால் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட செல்களின் அடர்த்தி 1.61 ± 0.34% ஆக இருந்தது என்றும் ஆய்வு முடிவுகள் காட்டின (படம் 7a). இந்த முடிவுகள், அரபிடாப்சிஸில் KAND 11 சிகிச்சையானது புறணி நுண்குழாய்களின் பாலிமர் சிதைவைத் தூண்டுகிறது என்ற அவதானிப்புடன் ஒத்துப்போகின்றன (படம் 6b). அதே செறிவில் KAND 11 கொண்டு சிகிச்சையளித்த பிறகு, GFP-ABD-குறியிடப்பட்ட ஆக்டின் இழைகளைக் கொண்ட BY-2 வரிசையையும் நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம், மேலும் KAND 11 சிகிச்சையானது ஆக்டின் இழைகளைச் சிதைத்ததைக் கண்டறிந்தோம். 1 மணி நேரத்திற்கு 50 μM அல்லது 100 μM KAND 11 கொண்டு சிகிச்சையளித்தபோது, ​​ஆக்டின் இழை அடர்த்தி முறையே 1.20 ± 0.62% அல்லது 0.61 ± 0.26% ஆகக் கணிசமாகக் குறைந்தது, அதேசமயம் DMSO-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல்களில் அடர்த்தி 1.69 ± 0.51% ஆக இருந்தது (படம் 2). 7b). இந்த முடிவுகள், ஆக்டின் இழைகளைப் பாதிக்காத புரோபைசமைடு மற்றும் நுண்குழாய்களைப் பாதிக்காத ஆக்டின் பாலிமர் சிதைப்பானான லேட்ரன்குலின் B ஆகியவற்றின் விளைவுகளிலிருந்து வேறுபடுகின்றன (துணைத் தகவல் படம் S6). மேலும், கௌமோனமைடு 1, கௌமோனமைடு அமிலம் 6, அல்லது KAND 11 உடனான சிகிச்சையானது ஹீலா செல்களில் உள்ள நுண்குழாய்களைப் பாதிக்கவில்லை (துணைத் தகவல் படம் S7). எனவே, KAND 11-இன் செயல்பாட்டு வழிமுறையானது, அறியப்பட்ட சைட்டோஸ்கெலட்டன் சீர்குலைப்பிகளின் செயல்பாட்டு வழிமுறையிலிருந்து வேறுபட்டதாக நம்பப்படுகிறது. மேலும், KAND 11-ஆல் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட BY-2 செல்களை நாங்கள் நுண்ணோக்கி மூலம் ஆய்வு செய்ததில், KAND 11 சிகிச்சையின் போது செல் இறப்பு தொடங்கியது தெரியவந்தது. மேலும், KAND 11 சிகிச்சையின் 30 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு எவன்ஸ் நீலச்சாயம் பூசப்பட்ட இறந்த செல்களின் விகிதம் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரிக்கவில்லை என்றும், ஆனால் 50 μM அல்லது 100 μM KAND கொண்டு 90 நிமிடங்கள் சிகிச்சையளித்த பிறகு, இறந்த செல்களின் எண்ணிக்கை முறையே 43.7% அல்லது 80.1% ஆக அதிகரித்தது என்றும் அது காட்டியது (படம் 7c). மொத்தத்தில், இந்தத் தரவுகள், புதிய அர்சோலிக் அமில வழித்தோன்றலான KAND 11 என்பது, முன்னர் அறியப்படாத செயல்பாட்டு வழிமுறையைக் கொண்ட ஒரு தாவரத்திற்கே உரிய சைட்டோஸ்கெலட்டன் தடுப்பான் என்பதைக் குறிக்கின்றன.
KAND புகையிலை BY-2 செல்களின் புறணி நுண்குழாய்கள், ஆக்டின் இழைகள் மற்றும் உயிர்வாழும் தன்மையைப் பாதிக்கிறது. (அ) TagRFP-TUA6 முன்னிலையில் BY-2 செல்களில் உள்ள புறணி நுண்குழாய்களைக் காட்சிப்படுத்துதல். KAND 11 (50 μM அல்லது 100 μM) அல்லது DMSO கொண்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட BY-2 செல்கள் கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி மூலம் ஆராயப்பட்டன. 25 தனித்தனி செல்களின் நுண்படங்களிலிருந்து புறணி நுண்குழாய் அடர்த்தி கணக்கிடப்பட்டது. எழுத்துக்கள் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (டூக்கி HSD சோதனை, p < 0.05).< 0.05). அளவுகோல் பட்டை = 10 µm. (b) GFP-ABD2 முன்னிலையில் BY-2 செல்களில் காட்சிப்படுத்தப்பட்ட புறணி ஆக்டின் இழைகள். KAND 11 (50 μM அல்லது 100 μM) அல்லது DMSO உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட BY-2 செல்கள் கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. 25 தனிப்பட்ட செல்களின் நுண்ணுயிர்ப் படங்களிலிருந்து புறணி ஆக்டின் இழைகளின் அடர்த்தி கணக்கிடப்பட்டது. எழுத்துக்கள் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (டூக்கி HSD சோதனை, p < 0.05).< 0.05). அளவுகோல் பட்டை = 10 µm. (c) எவன்ஸ் நீல நிறமி கொண்டு இறந்த BY-2 செல்களைக் கண்டறிதல். KAND 11 (50 μM அல்லது 100 μM) அல்லது DMSO கொண்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட BY-2 செல்கள் பிரகாச-புல நுண்ணோக்கி மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. n=3. அளவுகோல் பட்டை = 100 µm.
புதிய இயற்கை விளைபொருட்களின் கண்டுபிடிப்பும் பயன்பாடும், மருத்துவம் மற்றும் விவசாயம் உட்பட மனித வாழ்வின் பல்வேறு அம்சங்களில் குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றங்களுக்கு வழிவகுத்துள்ளன. இயற்கை வளங்களிலிருந்து பயனுள்ள சேர்மங்களைப் பெறுவதற்காக வரலாற்று ஆராய்ச்சிகள் மேற்கொள்ளப்பட்டுள்ளன. குறிப்பாக, ஆக்டினோமைசீட்கள், ஐவர்மெக்டினின் முதன்மைச் சேர்மமான அவெர்மெக்டின் மற்றும் புற்றுநோய் எதிர்ப்பு மருந்தாக மருத்துவ ரீதியாகப் பயன்படுத்தப்படும் ப்ளியோமைசின் மற்றும் அதன் வழிப்பொருட்கள் போன்ற பல்வேறு இரண்டாம் நிலை வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களை உற்பத்தி செய்யும் திறனைக் கொண்டிருப்பதால், நூற்புழுக்களுக்கு எதிரான ஒட்டுண்ணி எதிர்ப்பு நுண்ணுயிர் எதிர்ப்பிகளாகப் பயன்படுகின்றன என்பது அறியப்படுகிறது²¹,²². அதேபோல், ஆக்டினோமைசீட்களிலிருந்து பல்வேறு களைக்கொல்லி சேர்மங்கள் கண்டுபிடிக்கப்பட்டுள்ளன, அவற்றில் சில ஏற்கனவே வணிக ரீதியாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன¹,²³. எனவே, விரும்பிய உயிரியல் செயல்பாடுகளைக் கொண்ட இயற்கை விளைபொருட்களைப் பிரித்தெடுப்பதற்காக ஆக்டினோமைசீட் வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களைப் பகுப்பாய்வு செய்வது ஒரு சிறந்த உத்தியாகக் கருதப்படுகிறது. இந்த ஆய்வில், நாங்கள் S. werraensis-இலிருந்து கௌமோனமைடு என்ற ஒரு புதிய சேர்மத்தைக் கண்டுபிடித்து, அதை வெற்றிகரமாகத் தொகுத்தோம். அர்சோனிக் அமிலம் என்பது அர்பெனமைடு மற்றும் அதன் வழிப்பொருட்களின் ஒரு செயற்கை இடைநிலை ஆகும். இது வேர்களில் ஒரு குறிப்பிட்ட சுருளலை ஏற்படுத்தலாம், மிதமானது முதல் வலுவான களைக்கொல்லிச் செயல்பாட்டைக் காட்டலாம், மேலும் நேரடியாகவோ அல்லது மறைமுகமாகவோ தாவர நுண்குழாய்களைச் சேதப்படுத்தலாம். இருப்பினும், உர்மோடோனிக் அமிலத்தின் செயல்பாட்டு முறை, தற்போதுள்ள நுண்குழாய் தடுப்பான்களிலிருந்து வேறுபடலாம், ஏனெனில் KAND 11 ஆக்டின் இழைகளையும் சிதைத்து, செல் இறப்பை ஏற்படுத்துகிறது. இது, உர்மோடோனிக் அமிலமும் அதன் வழிப்பொருட்களும் பரந்த அளவிலான சைட்டோஸ்கெலெட்டல் கட்டமைப்புகளைப் பாதிக்கும் ஒரு ஒழுங்குமுறைப் பொறிமுறையைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டுகிறது.
அர்பெனோனிக் அமிலத்தின் மேலும் விரிவான பண்புக்கூறுகளை ஆராய்வது, அதன் செயல்பாட்டு வழிமுறையை நன்கு புரிந்துகொள்ள உதவும். குறிப்பாக, அர்சோனிக் அமிலமும் அதன் வழிப்பொருட்களும் நுண்குழாய்கள் மீது நேரடியாகச் செயல்பட்டு அவற்றை சிதைக்கின்றனவா, அல்லது அவற்றின் செயல்பாடு நுண்குழாய்களின் நிலைத்தன்மையைக் குலைக்கிறதா என்பதைத் தீர்மானிக்க, ஒடுக்கப்பட்ட நுண்குழாய்களுடன் அர்சோனிக் அமிலம் பிணைக்கும் திறனை மதிப்பிடுவதே அடுத்த இலக்காகும். மேலும், நுண்குழாய்கள் நேரடி இலக்காக இல்லாத நேர்வில், தாவர செல்களில் அர்சோனிக் அமிலத்தின் செயல்பாட்டுத் தளம் மற்றும் மூலக்கூறு இலக்குகளைக் கண்டறிவது, தொடர்புடைய சேர்மங்களின் பண்புகளையும் களைக்கொல்லிச் செயல்பாட்டை மேம்படுத்துவதற்கான சாத்தியமான வழிகளையும் மேலும் புரிந்துகொள்ள உதவும். எங்களின் உயிரியல் செயல்பாட்டுச் சோதனையானது, அரபிடாப்சிஸ் தாலியானா, புகையிலை மற்றும் லிவர்வார்ட் போன்ற தாவரங்களின் வளர்ச்சியில் அர்சோனிக் அமிலத்தின் தனித்துவமான செல்நச்சுத் திறனை வெளிப்படுத்தியது; அதே சமயம், ஈ. கோலை அல்லது ஹீலா செல்கள் பாதிக்கப்படவில்லை. திறந்தவெளி விவசாய நிலங்களில் பயன்படுத்துவதற்காக அர்சோனிக் அமில வழிப்பொருட்கள் களைக்கொல்லிகளாக உருவாக்கப்பட்டால், விலங்கு செல்களுக்கு மிகக் குறைந்த அல்லது நச்சுத்தன்மையற்ற தன்மை ஒரு நன்மையாகும். உண்மையில், நுண்குழாய்கள் யூக்கரியோட்டுகளில் பொதுவான கட்டமைப்புகளாக இருப்பதால், தாவரங்களில் அவற்றின் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட தடுப்பு களைக்கொல்லிகளுக்கு ஒரு முக்கியத் தேவையாகும். எடுத்துக்காட்டாக, புரோபைசமைடு, டியூபுலினுடன் நேரடியாகப் பிணைந்து பாலிமரைசேஷனைத் தடுக்கும் ஒரு நுண்குழாய் சிதைக்கும் காரணி, விலங்கு செல்களுக்கு அதன் குறைந்த நச்சுத்தன்மை காரணமாக ஒரு களைக்கொல்லியாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது²⁴. டைசோபிரமைடுக்கு மாறாக, தொடர்புடைய பென்சமைடுகள் வெவ்வேறு இலக்குத் தனித்தன்மைகளைக் கொண்டுள்ளன. தாவர நுண்குழாய்கள் தவிர, RH-4032 அல்லது பென்சோக்சமைடு முறையே விலங்கு செல்கள் அல்லது ஊமைசீட்டுகளின் நுண்குழாய்களையும் தடுக்கின்றன, மேலும் சாலிலமைடு அதன் குறைந்த தாவர நச்சுத்தன்மை காரணமாக ஒரு பூஞ்சைக்கொல்லியாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது²⁵,²⁶,²⁷. புதிதாகக் கண்டுபிடிக்கப்பட்ட பியர் மற்றும் அதன் வழித்தோன்றல்கள் தாவரங்களுக்கு எதிராகத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட செல்நச்சுத்தன்மையைக் காட்டுகின்றன, ஆனால் மேலும் மாற்றங்கள் அவற்றின் இலக்குத் தனித்தன்மையை மாற்றக்கூடும், இது நோய்க்கிருமி பூஞ்சைகள் அல்லது ஊமைசீட்டுகளைக் கட்டுப்படுத்துவதற்கு கூடுதல் வழித்தோன்றல்களை வழங்கக்கூடும் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது.
அர்பெனோனிக் அமிலம் மற்றும் அதன் வழிப்பொருட்களின் தனித்துவமான பண்புகள், அவற்றை களைக்கொல்லிகளாக உருவாக்குவதற்கும் ஆராய்ச்சி கருவிகளாகப் பயன்படுத்துவதற்கும் பயனுள்ளதாக இருக்கின்றன. தாவர செல் வடிவத்தைக் கட்டுப்படுத்துவதில் சைட்டோஸ்கெலட்டனின் முக்கியத்துவம் பரவலாக அங்கீகரிக்கப்பட்டுள்ளது. முந்தைய ஆய்வுகள், தாவரங்கள் உருவ உருவாக்கத்தை முறையாகக் கட்டுப்படுத்துவதற்காக நுண்குழாய் இயக்கவியலைக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம், புறணி நுண்குழாய் அமைப்பின் சிக்கலான வழிமுறைகளை உருவாக்கியுள்ளன என்பதைக் காட்டியுள்ளன. நுண்குழாய் செயல்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்துவதற்குப் பொறுப்பான ஏராளமான மூலக்கூறுகள் அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன, மேலும் அது தொடர்பான ஆராய்ச்சி இன்னும் தொடர்கிறது3,4,28. தாவர செல்களில் உள்ள நுண்குழாய் இயக்கவியல் பற்றிய நமது தற்போதைய புரிதல், புறணி நுண்குழாய் அமைப்பின் வழிமுறைகளை முழுமையாக விளக்கவில்லை. உதாரணமாக, டைசோபிரமைடு மற்றும் ஒரைசாலின் ஆகிய இரண்டுமே நுண்குழாய்களை சிதைக்கக் கூடியவை என்றாலும், டைசோபிரமைடு கடுமையான வேர் சிதைவை ஏற்படுத்துகிறது, அதேசமயம் ஒரைசாலின் ஒப்பீட்டளவில் மிதமான விளைவையே ஏற்படுத்துகிறது. மேலும், நுண்குழாய்களை நிலைப்படுத்தும் டியூபுலினில் ஏற்படும் பிறழ்வுகள், வேர்களில் வலஞ்சுழற்சியையும் ஏற்படுத்துகின்றன, அதேசமயம் நுண்குழாய் இயக்கவியலை நிலைப்படுத்தும் பேக்லிடாக்செல் அவ்வாறு செய்வதில்லை. எனவே, அர்சோலிக் அமிலத்தின் மூலக்கூறு இலக்குகளைப் பற்றி ஆய்வு செய்து கண்டறிவது, தாவரப் புறணி நுண்குழாய்களின் ஒழுங்குமுறை குறித்த புதிய புரிதல்களை வழங்கும். அதேபோல், டைசோபிரமைடு போன்ற, உருக்குலைந்த வளர்ச்சியை ஊக்குவிப்பதில் திறம்படச் செயல்படும் வேதிப்பொருட்களையும், ஒரைசாலின் அல்லது குமாமோட்டோரிக் அமிலம் போன்ற, குறைந்த செயல்திறன் கொண்ட வேதிப்பொருட்களையும் எதிர்காலத்தில் ஒப்பிடுவது, உருக்குலைந்த வளர்ச்சி எவ்வாறு ஏற்படுகிறது என்பதற்கான தடயங்களை வழங்கும்.
மறுபுறம், பாதுகாப்பு தொடர்பான சைட்டோஸ்கெலெட்டல் மறுசீரமைப்புகள், அர்சோனிக் அமிலத்தின் செல்நச்சுத்தன்மையை விளக்குவதற்கான மற்றொரு சாத்தியமாகும். ஒரு நோய்க்கிருமியின் தொற்று அல்லது தாவர செல்களுக்குள் ஒரு தூண்டியை அறிமுகப்படுத்துவது சில சமயங்களில் சைட்டோஸ்கெலெட்டனின் அழிவையும் அதைத் தொடர்ந்த செல் இறப்பையும் ஏற்படுத்துகிறது²⁹. உதாரணமாக, ஊமைசீட்டிலிருந்து பெறப்பட்ட கிரிப்டோசாந்தின், புகையிலை செல் இறப்பிற்கு முன்னர் நுண்குழாய்கள் மற்றும் ஆக்டின் இழைகளைச் சிதைப்பதாகப் பதிவாகியுள்ளது; இது KAND சிகிச்சையில் நிகழ்வதைப் போன்றது³⁰,³¹. அர்சோனிக் அமிலத்தால் தூண்டப்பட்ட பாதுகாப்பு எதிர்வினைகளுக்கும் செல்லுலார் எதிர்வினைகளுக்கும் இடையிலான ஒற்றுமைகள், அவை பொதுவான செல்லுலார் செயல்முறைகளைத் தூண்டுகின்றன என்ற கருதுகோளை உருவாக்க எங்களை வழிநடத்தின; இருப்பினும், கிரிப்டோசாந்தினை விட அர்சோனிக் அமிலத்தின் வேகமான மற்றும் வலுவான விளைவு தெளிவாகத் தெரிகிறது. ஆயினும்கூட, ஆக்டின் இழைகளின் சிதைவு தன்னிச்சையான செல் இறப்பை ஊக்குவிக்கிறது என்றும், இது எப்போதும் நுண்குழாய் சிதைவுடன் சேர்ந்து நிகழ்வதில்லை என்றும் ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன²⁹. கூடுதலாக, அர்சோனிக் அமில வழித்தோன்றல்களைப் போலவே, நோய்க்கிருமியோ அல்லது தூண்டியோ சிதைந்த வேர் வளர்ச்சியை ஏற்படுத்துகிறதா என்பதைப் பார்க்க வேண்டியுள்ளது. எனவே, பாதுகாப்பு எதிர்வினைகளையும் உயிரணுக்கூட்டையும் இணைக்கும் மூலக்கூறு அறிவு, ஆராயப்பட வேண்டிய ஒரு கவர்ச்சிகரமான பிரச்சனையாகும். அர்சோனிக் அமிலத்துடன் தொடர்புடைய குறைந்த மூலக்கூறு எடை கொண்ட சேர்மங்களின் இருப்பையும், மாறுபட்ட ஆற்றல்களைக் கொண்ட பலதரப்பட்ட வழிப்பொருட்களையும் பயன்படுத்திக் கொள்வதன் மூலம், அறியப்படாத உயிரணு இயக்கமுறைகளைக் குறிவைக்க அவை வாய்ப்புகளை வழங்கக்கூடும்.
ஒட்டுமொத்தமாகப் பார்க்கையில், நுண்குழாய் இயக்கவியலை நெறிப்படுத்தும் புதிய சேர்மங்களைக் கண்டறிந்து பயன்படுத்துவது, தாவர செல் வடிவ நிர்ணயத்தின் அடிப்படையிலான சிக்கலான மூலக்கூறு இயக்கமுறைகளைக் கையாள்வதற்கான சக்திவாய்ந்த வழிமுறைகளை வழங்கும். இந்தச் சூழலில், நுண்குழாய்கள் மற்றும் ஆக்டின் இழைகளைப் பாதித்து, செல் இறப்பைத் தூண்டும், சமீபத்தில் உருவாக்கப்பட்ட சேர்மமான அர்பெனோனிக் அமிலம், நுண்குழாய்க் கட்டுப்பாட்டிற்கும் இந்த மற்ற இயக்கமுறைகளுக்கும் இடையிலான தொடர்பைப் புரிந்துகொள்வதற்கான ஒரு வாய்ப்பை வழங்கக்கூடும். எனவே, அர்பெனோனிக் அமிலத்தைப் பயன்படுத்தி செய்யப்படும் வேதியியல் மற்றும் உயிரியல் பகுப்பாய்வு, தாவர சைட்டோஸ்கெலட்டனைக் கட்டுப்படுத்தும் மூலக்கூறு ஒழுங்குமுறை இயக்கமுறைகளைப் புரிந்துகொள்ள நமக்கு உதவும்.
2% (w/v) கேலக்டோஸ், 2% (w/v) எசென்ஸ் பேஸ்ட், 1% (w/v) பாக்டோ கலவை - சோயாடன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், இன்க்.), 0.5% (w/v) சோளச் சாறு (கோகோஸ்ட் கோ., லிமிடெட், ஜப்பான்), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 மற்றும் 0.2% CaCO3 ஆகியவற்றை அயனியகற்றப்பட்ட நீரில் கொண்ட 110 மிலி விதை ஊடகத்தை உள்ளடக்கிய 500 மிலி தடுப்புடைய எர்லன்மேயர் குடுவையில் S. werraensis MK493-CF1 இடப்பட்டது. (நுண்ணுயிர் நீக்கத்திற்கு முன் pH 7.4). விதை வளர்ப்புகள் 27°C வெப்பநிலையில், ஒரு சுழலும் கலக்கியில் (180 rpm) 2 நாட்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டன. திட நிலை நொதித்தல் மூலம் உற்பத்தி சாகுபடி. விதை வளர்ப்பு (7 மிலி), 15 கிராம் அழுத்தப்பட்ட பார்லி (MUSO Co., Ltd., ஜப்பான்) மற்றும் 25 கிராம் அயனியகற்றப்பட்ட நீர் (நுண்ணுயிரற்றதாக்கலுக்கு முன் pH சரிசெய்யப்படவில்லை) ஆகியவற்றைக் கொண்ட 40 கிராம் உற்பத்தி ஊடகம் உள்ள 500 மிலி K-1 குடுவைக்கு மாற்றப்பட்டது. நொதித்தல் 30°C வெப்பநிலையில், இருட்டில் 14 நாட்களுக்கு மேற்கொள்ளப்பட்டது. நொதித்தல் பொருளானது 40 மிலி/குடுவை EtOH கொண்டு பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது (1500 g, 4°C, 10 நிமிடம்). வளர்ப்பின் மேல்தேங்கிய திரவமானது (60 மிலி), 10% MeOH/EtOAc கலவையைக் கொண்டு பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. கரிம அடுக்கு குறைக்கப்பட்ட அழுத்தத்தின் கீழ் ஆவியாக்கப்பட்டு ஒரு எச்சம் (59.5 மி.கி) பெறப்பட்டது, இது ஒரு ரிவர்ஸ் ஃபேஸ் காலம் (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × நீளம் 250 mm) மீது கிரேடியன்ட் எல்யூஷன் (0–10 நிமிடங்கள்: 90%) உடன் HPLCக்கு உட்படுத்தப்பட்டது: H2O/CH3CN, 10–35 நிமிடங்கள்: 90% H2O/CH3CN முதல் 70% H2O/CH3CN வரை (கிரேடியன்ட்), 35–45 நிமிடங்கள்: 90% H2O/EtOH, 45–155 நிமிடங்கள்: 90% H2O/EtOH முதல் 100% EtOH வரை (கிரேடியன்ட்), 155–200 நிமிடங்கள்: 100% EtOH) 1.5 மி.லி/நிமிடம் என்ற பாய்வு விகிதத்தில், கௌமோனமைடு (1, 36.0 மி.கி) ஒரு வெள்ளை உருவமற்ற தூளாகப் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது.
குமாமோட்டோஅமைடு(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ கணக்கிடப்பட்ட மதிப்பு: 141.0659, அளவிடப்பட்ட மதிப்பு: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
கொலம்பியா விதைகள் (Col-0) அரபிடாப்சிஸ் உயிரியல் வள மையத்திலிருந்து (ABRC) ஆராய்ச்சிப் பயன்பாட்டிற்கான அனுமதியுடன் பெறப்பட்டன. Col-0 விதைகள் எங்கள் ஆய்வகச் சூழலில் வளர்க்கப்பட்டுப் பராமரிக்கப்பட்டு, இயல்புவகை அரபிடாப்சிஸ் தாவரங்களாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. அரபிடாப்சிஸ் விதைகள் மேற்பரப்பு கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்டு, 2% சுக்ரோஸ் (ஃபுஜிஃபில்ம் வாகோ ப்யூர் கெமிக்கல்), 0.05% (w/v) 2-(4-மார்போலினோ)எத்தேன்சல்பானிக் அமிலம் (MES) (ஃபுஜிஃபில்ம் வாகோ ப்யூர் கெமிக்கல்) மற்றும் 1.5% அகர் (ஃபுஜிஃபில்ம் வாகோ ப்யூர் கெமிக்கல்) ஆகியவற்றைக் கொண்ட அரை-வலிமை முராஷிகே மற்றும் ஸ்கூக் ஊடகத்தில், pH 5.7, 23 °C வெப்பநிலையிலும் நிலையான ஒளியிலும் வளர்க்கப்பட்டன. phs1-1 சடுதிமாற்றியின் விதைகள் டி. ஹஷிமோட்டோ (நாரா அறிவியல் மற்றும் தொழில்நுட்ப நிறுவனம்) அவர்களால் வழங்கப்பட்டன.
SR-1 ரகத்தின் விதைகள், டி. ஹஷிமோட்டோ (நாரா அறிவியல் மற்றும் தொழில்நுட்ப நிறுவனம்) அவர்களால் வழங்கப்பட்டு, காட்டு வகை புகையிலைச் செடிகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. புகையிலை விதைகள் மேற்பரப்பு கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்டு, முளைத்தலை ஊக்குவிப்பதற்காக மூன்று இரவுகள் கிருமியற்ற நீரில் ஊறவைக்கப்பட்டன. பின்னர் அவை, 2% சுக்ரோஸ், 0.05% (w/v) MES, மற்றும் 0.8% ஜெலன் கம் (ஃபுஜிஃபில்ம் வாகோ ப்யூர் கெமிக்கல்) முராஷிகே மற்றும் ஸ்கூக் ஊடகம் ஆகியவற்றைக் கொண்ட, pH 5.7 உடைய பாதி செறிவுள்ள கரைசலில் இடப்பட்டு, 23°C வெப்பநிலையில் தொடர்ச்சியான ஒளியின் கீழ் அடைகாக்கப்பட்டன.
டாக்-1 திரிபு, கியோட்டோ பல்கலைக்கழகத்தைச் சேர்ந்த டி. கோச்சியால் வழங்கப்பட்டது மற்றும் ஈரல்பாசி ஆய்விற்கான தரநிலை சோதனை அலகாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்ட வளர்ப்புத் தாவரங்களிலிருந்து ஜெம்மா பெறப்பட்டு, பின்னர் 1% சுக்ரோஸ் மற்றும் 0.3% ஜெலன் கம் கொண்ட காம்போர்க் B5 ஊடகத்தில் (ஃபுஜிஃபில்ம் வாகோ ப்யூர் கெமிக்கல்) தட்டுகளில் இடப்பட்டு, தொடர்ச்சியான ஒளியின் கீழ் 23°C வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்பட்டது.
புகையிலை BY-2 செல்கள் (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. ஹசேசாவா (டோக்கியோ பல்கலைக்கழகம்) அவர்களால் வழங்கப்பட்டன. BY-2 செல்கள், மாற்றியமைக்கப்பட்ட லின்ஸ்மியர் மற்றும் ஸ்கூக் ஊடகத்தில் 95 மடங்கு நீர்க்கப்பட்டு, வாரந்தோறும் 2,4-டைகுளோரோஃபீனாக்ஸிஅசிட்டிக் அமிலம் 32 உடன் கூடுதலாகச் சேர்க்கப்பட்டன. செல் கூழ்மமானது, இருட்டில் 27°C வெப்பநிலையில், ஒரு சுழலும் கலக்கியில் 130 rpm வேகத்தில் கலக்கப்பட்டது. செல்களை, அதன் கன அளவை விட 10 மடங்கு புதிய ஊடகத்தைக் கொண்டு கழுவி, அதே ஊடகத்தில் மீண்டும் கூழ்மமாக்கவும். காலிஃபிளவர் மொசைக் வைரஸ் 35S ஊக்குவிப்பானின் கீழ், நுண்குழாய் குறிப்பானான TagRFP-TUA6 அல்லது ஆக்டின் இழை குறிப்பானான GFP-ABD2-ஐ நிலையாக வெளிப்படுத்தும் BY-2 மரபணு மாற்றப்பட்ட செல் வரிசைகள், விவரிக்கப்பட்டபடி33,34,35 உருவாக்கப்பட்டன. இந்த செல் வரிசைகளை, அசல் BY-2 செல் வரிசைக்குப் பயன்படுத்தப்பட்ட அதே நடைமுறைகளைப் பயன்படுத்திப் பராமரிக்கவும் ஒத்திசைக்கவும் முடியும்.
10% கரு மாட்டு சீரம், 1.2 U/ml பெனிசிலின் மற்றும் 1.2 μg/ml ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் ஆகியவை கூடுதலாகச் சேர்க்கப்பட்ட டல்பெக்கோவின் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈகிள்ஸ் ஊடகத்தில் (DMEM) (லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), 5% CO2 சூழல் கொண்ட 37°C வெப்பமானியில் ஹீலா செல்கள் வளர்க்கப்பட்டன.
இந்தக் கையெழுத்துப் பிரதியில் விவரிக்கப்பட்டுள்ள அனைத்து சோதனைகளும் ஜப்பானிய உயிரியல் பாதுகாப்பு விதிமுறைகள் மற்றும் வழிகாட்டுதல்களுக்கு இணங்க மேற்கொள்ளப்பட்டன.
சேர்மங்கள் டைமெத்தில் சல்ஃபாக்சைடில் (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) மூலக் கரைசல்களாகக் கரைக்கப்பட்டு, அரபிடாப்சிஸ் மற்றும் புகையிலைக்கு MS ஊடகத்திலும், ஈரல்பாசிக்கு காம்போர்க் B5 ஊடகத்திலும் நீர்க்கப்பட்டன. வேர் வளர்ச்சித் தடுப்புச் சோதனைக்காக, ஒரு தட்டிற்கு 10-க்கும் மேற்பட்ட விதைகள், குறிப்பிடப்பட்ட சேர்மங்கள் அல்லது DMSO-வைக் கொண்ட அகார் ஊடகத்தில் விதைக்கப்பட்டன. விதைகள் ஒரு வளர்ச்சி அறையில் 7 நாட்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டன. நாற்றுகள் புகைப்படம் எடுக்கப்பட்டு, வேர்களின் நீளம் அளவிடப்பட்டது. அரபிடாப்சிஸ் முளைப்புச் சோதனைக்காக, ஒரு தட்டிற்கு 48 விதைகள், 200 μM சேர்மம் அல்லது DMSO-வைக் கொண்ட அகார் ஊடகத்தில் விதைக்கப்பட்டன. அரபிடாப்சிஸ் விதைகள் ஒரு வளர்ச்சி அறையில் வளர்க்கப்பட்டு, முளைத்த 7 நாட்களுக்குப் பிறகு (dag) முளைத்த நாற்றுகளின் எண்ணிக்கை எண்ணப்பட்டது. புகையிலை முளைப்புச் சோதனைக்காக, ஒரு தட்டிற்கு 24 விதைகள், 200 μM KAND அல்லது DMSO-வைக் கொண்ட அகார் ஊடகத்தில் விதைக்கப்பட்டன. புகையிலை விதைகள் ஒரு வளர்ச்சி அறையில் வளர்க்கப்பட்டு, 14 நாட்களுக்குப் பிறகு முளைத்த நாற்றுகளின் எண்ணிக்கை கணக்கிடப்பட்டது. ஈரல்பாசி வளர்ச்சித் தடுப்புச் சோதனைக்காக, ஒவ்வொரு தட்டிலிருந்தும் 9 கருக்கள், குறிப்பிடப்பட்ட செறிவுகளில் KAND அல்லது DMSO-வைக் கொண்ட அகார் ஊடகத்தில் இடப்பட்டு, 14 நாட்களுக்கு ஒரு வளர்ச்சி அறையில் அடைகாக்கப்பட்டன.
வேர் மெரிஸ்டம் அமைப்பைக் காட்சிப்படுத்த, 5 மி.கி/மி.லி புரோபிடியம் அயோடைடு (PI) கொண்டு சாயமேற்றப்பட்ட நாற்றுகளைப் பயன்படுத்தவும். PI சமிக்ஞைகள், TCS SPE கான்கோகல் லேசர் ஸ்கேனிங் நுண்ணோக்கியைப் (Leica Microsystems) பயன்படுத்தி, ஃபுளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கி மூலம் உற்றுநோக்கப்பட்டன.
மலாமி மற்றும் பென்ஃபே36 விவரித்த நெறிமுறையின்படி, β-குளுக்கூரோனிடேஸ் (GUS) கொண்டு வேர்களுக்கு ஹிஸ்டோகெமிக்கல் சாயமேற்றம் செய்யப்பட்டது. நாற்றுகள் 90% அசிட்டோனில் இரவு முழுவதும் நிலைப்படுத்தப்பட்டு, GUS தாங்கல் கரைசலில் உள்ள 0.5 மி.கி/மி.லி 5-ப்ரோமோ-4-குளோரோ-3-இண்டோலில்-β-டி-குளுக்கூரோனிக் அமிலம் கொண்டு 1 மணி நேரம் சாயமேற்றப்பட்டு, நீரேற்றப்பட்ட குளோரால்டிஹைட் கரைசலில் (8 கிராம் குளோரல் ஹைட்ரேட், 2 மி.லி நீர் மற்றும் 1 மி.லி கிளிசரால்) வைக்கப்பட்டன. பின்னர், ஆக்சியோ இமேஜர் M1 நுண்ணோக்கியைப் (கார்ல் செய்ஸ்) பயன்படுத்தி வேறுபாட்டு குறுக்கீட்டு மாறுபாடு நுண்ணோக்கி மூலம் அவை உற்றுநோக்கப்பட்டன.
செங்குத்தாக வைக்கப்பட்ட தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்ட 7 நாள் நாற்றுகளின் வேர்க் கோணங்கள் அளவிடப்பட்டன. படி 6-இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, புவியீர்ப்பு திசையனிலிருந்து வேரின் கோணத்தை அளவிடவும்.
நெறிமுறை 37 இல் சிறிய மாற்றங்களுடன், விவரிக்கப்பட்டபடி புறணி நுண்குழாய்களின் அமைப்பு கவனிக்கப்பட்டது. ஆன்டி-β-டியூபுலின் ஆன்டிபாடி (KMX-1, மெர்க் மில்லிபோர்: MAB3408) மற்றும் அலெக்ஸா ஃப்ளூர் 488-இணைக்கப்பட்ட ஆன்டி-மவுஸ் IgG (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்: A32723) ஆகியவை முறையே 1:1000 மற்றும் 1:100 நீர்த்தல்களில் முதன்மை மற்றும் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. TCS SPE கான்கோகல் லேசர் ஸ்கேனிங் நுண்ணோக்கியைப் (லைகா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ்) பயன்படுத்தி ஒளிர்தல் படங்கள் பெறப்பட்டன. உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி Z-ஸ்டாக் படங்களைப் பெற்று, அதிகபட்ச செறிவு வீழல்களை உருவாக்கவும்.
உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, செல் கவுண்டிங் கிட் 8 (டோஜிண்டோ) பயன்படுத்தி ஹீலா செல் பெருக்கச் சோதனை மேற்கொள்ளப்பட்டது.
வளர்ப்பில் உள்ள செல் அடர்த்தியை 600 nm (OD600) நிறமாலைமானியைப் பயன்படுத்தி அளவிடுவதன் மூலம் E. coli DH5α-வின் வளர்ச்சி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
CSU-X1 கான்ஃபோகல் ஸ்கேனிங் சாதனம் (யோகோகாவா) மற்றும் ஒரு sCMOS கேமரா (சைலா, ஆண்டோர் டெக்னாலஜி) பொருத்தப்பட்ட ஒரு ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி, மரபணு மாற்றப்பட்ட BY-2 செல்களில் உள்ள சைட்டோஸ்கெலெட்டல் அமைப்பு கவனிக்கப்பட்டது. விவரிக்கப்பட்டபடி38,39, ImageJ மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி கான்ஃபோகல் படங்களில் உள்ள சைட்டோபிளாஸ்மிக் பிக்சல்களுக்கு இடையில் சைட்டோஸ்கெலெட்டல் பிக்சல்களின் சதவீதத்தை அளவிடும் படப் பகுப்பாய்வு மூலம் சைட்டோஸ்கெலெட்டல் அடர்த்தி மதிப்பிடப்பட்டது.
BY-2 செல்களில் செல் இறப்பைக் கண்டறிய, செல் சஸ்பென்ஷனின் ஒரு பகுதி அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு 0.05% எவன்ஸ் ப்ளூவுடன் இன்குபேட் செய்யப்பட்டது. இறந்த செல்களின் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட எவன்ஸ் ப்ளூ சாயமேற்றமானது, சிதைவுறாத பிளாஸ்மா சவ்வு மூலம் உயிருள்ள செல்களிலிருந்து சாயம் வெளியேற்றப்படுவதைச் சார்ந்துள்ளது40. சாயமேற்றப்பட்ட செல்கள் பிரைட்-ஃபீல்ட் மைக்ரோஸ்கோப் (BX53, ஒலிம்பஸ்) பயன்படுத்தி உற்றுநோக்கப்பட்டன.
ஹெலா செல்கள் 37°C மற்றும் 5% CO2 கொண்ட ஈரப்பதமூட்டப்பட்ட இன்குபேட்டரில், 10% FBS சேர்க்கப்பட்ட DMEM-ல் வளர்க்கப்பட்டன. செல்கள் 37°C வெப்பநிலையில் 6 மணி நேரத்திற்கு 100 μM KAND 11, குமாமோனாமிக் அமிலம் 6, குமாமோனாமைடு 1, 100 ng/ml கோல்செமிட் (கிப்கோ), அல்லது 100 ng/ml நோகோட்மேஸ் (சிக்மா) கொண்டு சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. செல்கள் அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு MetOH கொண்டும், பின்னர் 5 நிமிடங்களுக்கு அசிடேட் கொண்டும் நிலைப்படுத்தப்பட்டன. நிலைப்படுத்தப்பட்ட செல்கள், 0.5% BSA/PBS-ல் நீர்க்கப்பட்ட β-டியூபுலின் முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் (1D4A4, புரோட்டீன்டெக்: 66240-1) 2 மணி நேரம் இன்குபேட் செய்யப்பட்டு, TBST கொண்டு 3 முறை கழுவப்பட்டு, பின்னர் அலெக்ஸா ஃப்ளூர் வெள்ளாட்டு ஆன்டிபாடியுடன் 1 மணி நேரம் இன்குபேட் செய்யப்பட்டன. – 0.5% BSA/PBS-இல் நீர்க்கப்பட்ட மவுஸ் IgG (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்: A11001) மற்றும் 15 ng/ml 4′,6-டயமிடினோ-2-ஃபினைல்இண்டோல் (DAPI). TBST கொண்டு மூன்று முறை கழுவிய பிறகு, சாயமேற்றப்பட்ட செல்கள் நிக்கான் எக்லிப்ஸ் Ti-E தலைகீழ் நுண்ணோக்கியில் உற்றுநோக்கப்பட்டன. மெட்டாமார்ப் மென்பொருளை (மாலிகுலர் டிவைசஸ்) பயன்படுத்தி, குளிர்விக்கப்பட்ட ஹமாமாட்சு ORCA-R2 CCD கேமரா மூலம் படங்கள் எடுக்கப்பட்டன.