தாவர நுண்குழாய்களைப் பாதிக்கும் புதிய தாவர வளர்ச்சி தடுப்பான்களாக உர்சா மோனோஅமைடுகளின் கண்டுபிடிப்பு, தன்மைப்படுத்தல் மற்றும் செயல்பாட்டு மேம்பாடு.

Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியின் பதிப்பில் CSS ஆதரவு குறைவாகவே உள்ளது. சிறந்த முடிவுகளுக்கு, உங்கள் உலாவியின் புதிய பதிப்பைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்). இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைலிங் அல்லது ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தைக் காட்டுகிறோம்.
இயற்கைப் பொருட்களின் கண்டுபிடிப்பு மற்றும் நன்மை பயக்கும் பயன்பாடு மனித வாழ்க்கையை மேம்படுத்த உதவும். களைகளைக் கட்டுப்படுத்த தாவர வளர்ச்சியைத் தடுக்கும் இரசாயனங்கள் களைக்கொல்லிகளாக பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. பல்வேறு வகையான களைக்கொல்லிகளைப் பயன்படுத்த வேண்டியதன் காரணமாக, புதிய செயல்பாட்டு வழிமுறைகளுடன் கூடிய சேர்மங்களை அடையாளம் காண வேண்டிய அவசியம் உள்ளது. இந்த ஆய்வில், ஸ்ட்ரெப்டோமைசஸ் வெர்ரென்சிஸ் MK493-CF1 இலிருந்து கூமமோனமைடு என்ற புதிய N-அல்காக்ஸிபைரோல் கலவையைக் கண்டுபிடித்து முழுமையான தொகுப்பு செயல்முறையை நிறுவினோம். உயிரியல் செயல்பாட்டு மதிப்பீடுகள் மூலம், உர்ஸ்-மோனோஅமிக் அமிலம் உர்ஸ்-மோனோஅமைட்டின் செயற்கை இடைநிலை மற்றும் ஒரு ஆற்றல் வாய்ந்தது என்பதைக் கண்டறிந்தோம்.தாவர வளர்ச்சி தடுப்பான். கூடுதலாக, ஹெலா செல்களின் வளர்ச்சியை எதிர்மறையாக பாதிக்காமல் அதிக களைக்கொல்லி செயல்பாட்டைக் கொண்ட அர்பெனிலாக்ஸி வழித்தோன்றல் (UDA) உட்பட பல்வேறு அர்பெனோனிக் அமில வழித்தோன்றல்களை நாங்கள் உருவாக்கியுள்ளோம். உர்மோடோனிக் அமில வழித்தோன்றல்கள் தாவர நுண்குழாய்களை சீர்குலைப்பதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம்; கூடுதலாக, KAND ஆக்டின் இழைகளைப் பாதிக்கிறது மற்றும் செல் இறப்பைத் தூண்டுகிறது; இந்த பன்முக விளைவுகள் அறியப்பட்ட நுண்குழாய் தடுப்பான்களிலிருந்து வேறுபடுகின்றன மற்றும் உர்சோனிக் அமிலத்திற்கான ஒரு புதிய செயல்பாட்டு வழிமுறையை பரிந்துரைக்கின்றன, இது புதிய களைக்கொல்லிகளின் வளர்ச்சியில் ஒரு முக்கிய நன்மையைக் குறிக்கிறது.
நன்மை பயக்கும் இயற்கை பொருட்கள் மற்றும் அவற்றின் வழித்தோன்றல்களின் கண்டுபிடிப்பு மற்றும் நடைமுறை பயன்பாடு மனித வாழ்க்கைத் தரத்தை மேம்படுத்துவதற்கான ஒரு வழியாகும். நுண்ணுயிரிகள், தாவரங்கள் மற்றும் பூச்சிகளால் உற்பத்தி செய்யப்படும் இரண்டாம் நிலை வளர்சிதை மாற்றங்கள் மருத்துவம் மற்றும் விவசாயத்தில் பெரும் முன்னேற்றங்களுக்கு வழிவகுத்தன. பல நுண்ணுயிர் எதிர்ப்பிகள் மற்றும் லுகேமியா எதிர்ப்பு மருந்துகள் இயற்கை பொருட்களிலிருந்து உருவாக்கப்பட்டுள்ளன. கூடுதலாக, பல்வேறு வகையானபூச்சிக்கொல்லிகள், விவசாயத்தில் பயன்படுத்த இந்த இயற்கை பொருட்களிலிருந்து பூஞ்சைக் கொல்லிகள் மற்றும் களைக்கொல்லிகள் பிரித்தெடுக்கப்படுகின்றன. குறிப்பாக, களை கட்டுப்பாட்டு களைக்கொல்லிகள் நவீன விவசாயத்தில் பயிர் விளைச்சலை அதிகரிப்பதற்கான முக்கியமான கருவிகளாகும், மேலும் பல்வேறு வகையான சேர்மங்கள் ஏற்கனவே வணிக ரீதியாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. ஒளிச்சேர்க்கை, அமினோ அமில வளர்சிதை மாற்றம், செல் சுவர் தொகுப்பு, மைட்டோசிஸை ஒழுங்குபடுத்துதல், பைட்டோஹார்மோன் சமிக்ஞை செய்தல் அல்லது புரத தொகுப்பு போன்ற தாவரங்களில் உள்ள பல செல்லுலார் செயல்முறைகள் களைக்கொல்லிகளின் பொதுவான இலக்குகளாகக் கருதப்படுகின்றன. நுண்குழாய் செயல்பாட்டைத் தடுக்கும் சேர்மங்கள் மைட்டோடிக் ஒழுங்குமுறையை பாதிப்பதன் மூலம் தாவர வளர்ச்சியை பாதிக்கும் ஒரு பொதுவான வகை களைக்கொல்லிகளாகும்.
நுண்குழாய்கள் சைட்டோஸ்கெலட்டனின் கூறுகளாகும், மேலும் அவை யூகாரியோடிக் செல்களில் பரவலாகப் பாதுகாக்கப்படுகின்றன. டியூபுலின் ஹெட்டோரோடைமர் α-டியூபுலின் மற்றும் β-டியூபுலின் ஆகியவற்றைக் கொண்டு நேரியல் நுண்குழாய் புரோட்டோஃபிலமென்ட்களை உருவாக்குகிறது, இதில் 13 புரோட்டோஃபிலமென்ட்கள் ஒரு உருளை அமைப்பை உருவாக்குகின்றன. நுண்குழாய்கள் தாவர செல்களில் பல பாத்திரங்களை வகிக்கின்றன, இதில் செல் வடிவம், செல் பிரிவு மற்றும் உள்செல்லுலார் போக்குவரத்து ஆகியவை அடங்கும். தாவர செல்கள் இடைநிலை பிளாஸ்மா சவ்வுக்கு அடியில் நுண்குழாய்களைக் கொண்டுள்ளன, மேலும் இந்த கார்டிகல் மைக்ரோடியூபுல்கள் செல்லுலோஸ் சின்தேஸ் வளாகங்களை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் செல்லுலோஸ் மைக்ரோஃபைப்ரில்களின் அமைப்பைக் கட்டுப்படுத்துவதாக கருதப்படுகிறது. வேர் நுனியின் விரைவான நீட்சி மண்டலத்தில் இருக்கும் வேர் எபிடெர்மல் செல்களின் கார்டிகல் மைக்ரோடியூபுல்கள் பக்கவாட்டில் அமைந்துள்ளன, மேலும் செல்லுலோஸ் மைக்ரோஃபைபர்கள் இந்த நுண்குழாய்களைப் பின்பற்றி செல் விரிவாக்கத்தின் திசையை கட்டுப்படுத்துகின்றன, இதன் மூலம் அனிசோட்ரோபிக் செல் நீட்சியை ஊக்குவிக்கின்றன. எனவே, நுண்குழாய் செயல்பாடு தாவர உருவ அமைப்போடு நெருக்கமாக தொடர்புடையது. டியூபுலினை குறியாக்கம் செய்யும் மரபணுக்களில் உள்ள அமினோ அமில மாற்றீடுகள், அரபிடோப்சிஸ் 6,7 இல் கார்டிகல் மைக்ரோடியூபுல் வரிசைகளின் சாய்வையும் இடது அல்லது வலது பக்க வளர்ச்சியையும் ஏற்படுத்துகின்றன. இதேபோல், மைக்ரோடியூபுல் இயக்கவியலைக் கட்டுப்படுத்தும் மைக்ரோடியூபுல்-தொடர்புடைய புரதங்களில் ஏற்படும் பிறழ்வுகளும் சிதைந்த வேர் வளர்ச்சிக்கு வழிவகுக்கும்8,9,10,11,12,13. கூடுதலாக, பிரிட்டிலாக்ளோர் என்றும் அழைக்கப்படும் டிஸோபிரமைடு போன்ற மைக்ரோடியூபுல்-சீர்குலைக்கும் களைக்கொல்லிகளுடன் சிகிச்சையளிப்பது இடது பக்க சாய்ந்த வேர் வளர்ச்சியையும் ஏற்படுத்துகிறது14. தாவர வளர்ச்சியின் திசையை தீர்மானிக்க மைக்ரோடியூபுல் செயல்பாட்டின் துல்லியமான கட்டுப்பாடு மிக முக்கியமானது என்பதை இந்தத் தரவுகள் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
பல்வேறு வகையான நுண்குழாய் தடுப்பான்கள் கண்டுபிடிக்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் இந்த மருந்துகள் சைட்டோஸ்கெலிட்டல் ஆராய்ச்சிக்கும், விவசாயம் மற்றும் மருத்துவத்திற்கும் குறிப்பிடத்தக்க பங்களிப்பைச் செய்துள்ளன. குறிப்பாக, ஓரிசலின், டைனிட்ரோஅனிலின் சேர்மங்கள், டிஸோபிரமைடு, பென்சாமைடு தொடர்பான சேர்மங்கள் மற்றும் அவற்றின் ஒப்புமைகள் நுண்குழாய் செயல்பாட்டைத் தடுக்கலாம், இதன் மூலம் தாவர வளர்ச்சியைத் தடுக்கலாம். எனவே, அவை களைக்கொல்லிகளாக பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. இருப்பினும், நுண்குழாய்கள் தாவர மற்றும் விலங்கு செல்களின் ஒரு முக்கிய அங்கமாக இருப்பதால், பெரும்பாலான நுண்குழாய் தடுப்பான்கள் இரண்டு செல் வகைகளுக்கும் சைட்டோடாக்ஸிக் ஆகும். எனவே, களைக்கொல்லிகளாக அவற்றின் அங்கீகரிக்கப்பட்ட பயன்பாடு இருந்தபோதிலும், நடைமுறை நோக்கங்களுக்காக ஒரு குறிப்பிட்ட எண்ணிக்கையிலான நுண்ணுயிர் குழாய் முகவர்கள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
ஸ்ட்ரெப்டோமைசஸ் என்பது ஸ்ட்ரெப்டோமைசஸ் குடும்பத்தின் ஒரு இனமாகும், இதில் ஏரோபிக், கிராம்-பாசிட்டிவ், இழை பாக்டீரியாக்கள் அடங்கும் மற்றும் பரந்த அளவிலான இரண்டாம் நிலை வளர்சிதை மாற்றங்களை உற்பத்தி செய்யும் திறனுக்காக பரவலாக அறியப்படுகிறது. எனவே, இது புதிய உயிரியல் ரீதியாக செயல்படும் இயற்கை தயாரிப்புகளின் மிக முக்கியமான ஆதாரங்களில் ஒன்றாகக் கருதப்படுகிறது. தற்போதைய ஆய்வில், கூமமோனமைடு எனப்படும் ஒரு புதிய சேர்மத்தைக் கண்டுபிடித்தோம், இது ஸ்ட்ரெப்டோமைசஸ் வெர்ராயென்சிஸ் MK493-CF1 மற்றும் S. வெர்ராயென்சிஸ் ISP 5486 இலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டது. நிறமாலை பகுப்பாய்வு மற்றும் முழு நிறமாலை பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி, கூமமோனமைட்டின் அமைப்பு வகைப்படுத்தப்பட்டது மற்றும் அதன் தனித்துவமான N-ஆல்காக்ஸிபைரோல் எலும்புக்கூடு தீர்மானிக்கப்பட்டது. தொகுப்பு. உர்ஸ்மோனோமைடு மற்றும் அதன் வழித்தோன்றல்களின் செயற்கை இடைநிலையான உர்ஸ்மோனிக் அமிலம், பிரபலமான மாதிரி தாவரமான அரபிடோப்சிஸ் தாலியானாவின் வளர்ச்சி மற்றும் முளைப்பைத் தடுப்பதாகக் கண்டறியப்பட்டது. ஒரு கட்டமைப்பு-செயல்பாட்டு உறவு ஆய்வில், உர்சோனிக் அமிலமாக மாற்றியமைக்கப்பட்ட C9 உடன் கூடிய ஒரு சேர்மம், உர்சோனிக் அமிலத்தின் நோனிலாக்ஸி வழித்தோன்றல் (KAND) என அழைக்கப்படுகிறது, இது வளர்ச்சி மற்றும் முளைப்பில் தடுப்பு விளைவை கணிசமாக மேம்படுத்துகிறது என்பதைக் கண்டறிந்தோம். குறிப்பாக, புதிதாக கண்டுபிடிக்கப்பட்ட தாவர வளர்ச்சி தடுப்பான் புகையிலை மற்றும் லிவர்வோர்ட்டின் வளர்ச்சியையும் பாதித்தது மற்றும் பாக்டீரியா அல்லது HeLa செல்களுக்கு சைட்டோடாக்ஸிக் அல்ல. மேலும், சில உர்மோடோனிக் அமில வழித்தோன்றல்கள் ஒரு சிதைந்த வேர் பினோடைப்பைத் தூண்டுகின்றன, இந்த வழித்தோன்றல்கள் நேரடியாகவோ அல்லது மறைமுகமாகவோ நுண்குழாய்களைப் பாதிக்கின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த யோசனைக்கு இணங்க, இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிக்கல் அல்லது ஃப்ளோரசன்ட் புரதங்களுடன் பெயரிடப்பட்ட நுண்குழாய்களைப் பற்றிய எங்கள் அவதானிப்புகள், KAND சிகிச்சை நுண்குழாய்களை டிபாலிமரைஸ் செய்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. கூடுதலாக, குமாமோடோனிக் அமில வழித்தோன்றல்களுடன் சிகிச்சையானது ஆக்டின் நுண் இழைகளை சீர்குலைத்தது. இவ்வாறு, சைட்டோஸ்கெலட்டனை அழிப்பதை உள்ளடக்கிய தனித்துவமான செயல்பாட்டு பொறிமுறையான ஒரு புதிய தாவர வளர்ச்சி தடுப்பானை நாங்கள் கண்டுபிடித்துள்ளோம்.
டோக்கியோவின் ஷினகாவா-குவில் உள்ள மண்ணிலிருந்து MK493-CF1 விகாரம் தனிமைப்படுத்தப்பட்டது. விகாரம் MK493-CF1 நன்கு கிளைத்த ஸ்ட்ரோமல் மைசீலியத்தை உருவாக்கியது. 16S ரைபோசோமல் RNA மரபணுவின் (1422 bp) பகுதி வரிசை தீர்மானிக்கப்பட்டது. இந்த விகாரம் S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: வழக்கமான விகாரம், 99.93%) உடன் மிகவும் ஒத்திருக்கிறது. இந்த முடிவின் அடிப்படையில், இந்த விகாரம் S. werraensis வகை விகாரத்துடன் நெருங்கிய தொடர்புடையது என்று தீர்மானிக்கப்பட்டது. எனவே, இந்த விகாரத்தை நாங்கள் தற்காலிகமாக S. werraensis MK493-CF1 என்று பெயரிட்டோம். S. werraensis ISP 5486T அதே உயிரியல் ரீதியாக செயல்படும் சேர்மங்களையும் உருவாக்குகிறது. இந்த நுண்ணுயிரியிலிருந்து இயற்கையான பொருட்களைப் பெறுவதில் ஆரம்பகால ஆராய்ச்சி குறைவாக இருந்ததால், மேலும் வேதியியல் ஆராய்ச்சி மேற்கொள்ளப்பட்டது. 30°C வெப்பநிலையில் திட-நிலை நொதித்தல் மூலம் பார்லி ஊடகத்தில் S. werraensis MK493-CF1 ஐ 14 நாட்களுக்கு பயிரிட்ட பிறகு, அந்த ஊடகம் 50% EtOH உடன் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. 60 மில்லி மாதிரி உலர்த்தப்பட்டு 59.5 மிகி கச்சா சாறு பெறப்பட்டது. N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, coumamonamide என அழைக்கப்படுகிறது, 36.0 மிகி) கொடுக்க கச்சா சாறு HPLC இன் தலைகீழ் கட்டத்திற்கு உட்படுத்தப்பட்டது. 1 இன் மொத்த அளவு கச்சா சாற்றில் தோராயமாக 60% ஆகும். எனவே, குமமோட்டோஅமைடு 1 இன் பண்புகளை விரிவாக ஆய்வு செய்ய முடிவு செய்தோம்.
கூமமோனமைடு 1 என்பது ஒரு வெள்ளை நிறமாறாத தூள் மற்றும் உயர் தெளிவுத்திறன் கொண்ட நிறை நிறமாலை (HRESIMS) C6H8N2O2 ஐ உறுதிப்படுத்துகிறது (படம் 1). இந்த சேர்மத்தின் C2-பதிலீடு செய்யப்பட்ட பைரோல் துண்டு δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR நிறமாலையில் δH: 4.5 Hz, H-5) மற்றும் δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ஆகியவற்றால் வகைப்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் 13C NMR நிறமாலை நான்கு sp2 கார்பன் அணுக்களின் இருப்பைக் காட்டுகிறது. C2 நிலையில் ஒரு அமைடு குழுவின் இருப்பு δC 161.1 இல் C-3 புரோட்டானிலிருந்து அமைடு கார்போனைல் கார்பனுக்கு HMBC தொடர்பு மூலம் மதிப்பிடப்பட்டது. கூடுதலாக, δH 4.10 (3H, S) மற்றும் δC 68.3 இல் 1 H மற்றும் 13 C NMR உச்சங்கள் மூலக்கூறில் N-மெத்தாக்ஸி குழுக்கள் இருப்பதைக் குறிக்கின்றன. மெத்தாக்ஸி குழுவின் சரியான நிலை மேம்பட்ட வேறுபாடு நிறமாலை மற்றும் அணு ஓவர்ஹவுசர் சுருக்கம் (NOEDF) போன்ற நிறமாலை பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி இன்னும் தீர்மானிக்கப்படவில்லை என்றாலும், N-மெத்தாக்ஸி-1H-பைரோல்-2-கார்பாக்சமைடு முதல் வேட்பாளர் சேர்மமாக மாறியது.
1 இன் சரியான அமைப்பைத் தீர்மானிக்க, ஒரு மொத்த தொகுப்பு செய்யப்பட்டது (படம் 2a). வணிக ரீதியாகக் கிடைக்கும் 2-அமினோபிரிடின் 2 ஐ m-CPBA உடன் சிகிச்சையளிப்பதன் மூலம் அளவு மகசூலில் தொடர்புடைய N-ஆக்சைடு 3 கிடைத்தது. 2 இன் 2-அமினோஅசைடேஷனுக்குப் பிறகு, அப்ரமோவிச் விவரித்த சைக்ளோகன்டென்சேஷன் வினை பென்சீனில் 90°C இல் மேற்கொள்ளப்பட்டு, விரும்பிய 1-ஹைட்ராக்ஸி-1H-பைரோல்-2-கார்போனிட்ரைல் 5 கிராம் பெறப்பட்டது. வேகம் 60% (இரண்டு நிலைகள்). 15,16. 4 இன் மெத்திலேஷன் மற்றும் நீராற்பகுப்பு பின்னர் நல்ல மகசூலில் 1-மெத்தாக்ஸி-1H-பைரோல்-2-கார்பாக்சிலிக் அமிலத்தை ("குமோடோனிக் அமிலம்", 6 என அழைக்கப்படுகிறது) கொடுத்தது (70%, இரண்டு படிகள்). இறுதியாக, அக்வஸ் அம்மோனியாவைப் பயன்படுத்தி அமில குளோரைடு இடைநிலை 6 வழியாக அமிடேஷன் குமாமோட்டோ அமைடுக்கு 98% மகசூலில் 1 ஐக் கொடுத்தது. தொகுக்கப்பட்ட 1 இன் அனைத்து நிறமாலை தரவுகளும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட 1 ஐப் போலவே இருந்தன, எனவே 1 இன் அமைப்பு தீர்மானிக்கப்பட்டது;
உர்பெனமைடு மற்றும் உர்பெனிக் அமிலத்தின் உயிரியல் செயல்பாட்டின் பொதுவான தொகுப்பு மற்றும் பகுப்பாய்வு. (அ) குமாமோட்டோ அமைட்டின் மொத்த தொகுப்பு. (ஆ) ஏழு நாள் வயதுடைய காட்டு வகை அரபிடோப்சிஸ் கொலம்பியா (கோல்) நாற்றுகள் முராஷிகே மற்றும் ஸ்கூக் (எம்எஸ்) தட்டுகளில் கூமமோனமைடு 6 அல்லது கூமமோனமைடு 1 ஐக் கொண்டு சுட்டிக்காட்டப்பட்ட செறிவுகளில் வளர்க்கப்பட்டன. அளவுகோல் = 1 செ.மீ.
முதலில், தாவர வளர்ச்சியை மாற்றியமைக்கும் திறனுக்காக உர்பெனமைடு மற்றும் அதன் இடைநிலைகளின் உயிரியல் செயல்பாடுகளை நாங்கள் மதிப்பிட்டோம். எம்எஸ் அகார் ஊடகத்தில் உர்ஸ்மோனமைடு 1 அல்லது உர்ஸ்மோனிக் அமிலம் 6 இன் பல்வேறு செறிவுகளையும், இந்த ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்ட அரபிடோப்சிஸ் தாலியானா நாற்றுகளையும் சேர்த்தோம். இந்த மதிப்பீடுகள் 6 இன் அதிக செறிவுகள் (500 μM) வேர் வளர்ச்சியைத் தடுப்பதைக் காட்டின (படம் 2b). அடுத்து, 6 இன் N1 நிலையை மாற்றுவதன் மூலம் பல்வேறு வழித்தோன்றல்களை உருவாக்கி, அவற்றின் மீது கட்டமைப்பு-செயல்பாட்டு உறவு ஆய்வுகளை மேற்கொண்டோம் (அனலாக் தொகுப்பு செயல்முறை துணைத் தகவலில் (SI) விவரிக்கப்பட்டுள்ளது). அரபிடோப்சிஸ் நாற்றுகள் 50 μM உர்சோனிக் அமில வழித்தோன்றல்களைக் கொண்ட ஒரு ஊடகத்தில் வளர்க்கப்பட்டன, மேலும் வேர் நீளம் அளவிடப்பட்டது. படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி. படங்கள் 3a, b மற்றும் S1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, கூமாமோ அமிலங்கள் N1 நிலையில் வெவ்வேறு நீளங்களின் நேரியல் அல்காக்ஸி சங்கிலிகளைக் கொண்டுள்ளன (9, 10, 11, 12, மற்றும் 13) அல்லது பெரிய அல்காக்ஸி சங்கிலிகளைக் கொண்டுள்ளன (15, 16, மற்றும் 17). வழித்தோன்றல்கள் வேர் வளர்ச்சியை கணிசமாகத் தடுப்பதைக் காட்டின. கூடுதலாக, 200 μM 10, 11, அல்லது 17 ஐப் பயன்படுத்துவது முளைப்பதைத் தடுப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படங்கள் 3c மற்றும் S2).
குமாமோட்டோ அமைடு மற்றும் தொடர்புடைய சேர்மங்களின் கட்டமைப்பு-செயல்பாட்டு உறவின் ஆய்வு. (அ) ஒப்புமைகளின் கட்டமைப்பு மற்றும் தொகுப்பு திட்டம். (ஆ) 50 μM கூமமோனமைடு வழித்தோன்றல்களுடன் அல்லது இல்லாமல் MS ஊடகத்தில் வளர்க்கப்படும் 7 நாள் வயதுடைய நாற்றுகளின் வேர் நீளத்தின் அளவீடு. போலி சிகிச்சையுடன் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை நட்சத்திரக் குறிகள் குறிக்கின்றன (t சோதனை, ப< 0.05). n>18. தரவு சராசரி ± SD ஆகக் காட்டப்பட்டுள்ளது. nt என்பது "சோதனை செய்யப்படவில்லை" என்பதைக் குறிக்கிறது, ஏனெனில் 50% க்கும் அதிகமான விதைகள் முளைக்கவில்லை. (c) 200 μM கூமமோனமைடு மற்றும் தொடர்புடைய சேர்மங்களுடன் அல்லது இல்லாமல் MS ஊடகத்தில் 7 நாட்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்ட சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட விதைகளின் முளைப்பு விகிதத்தின் அளவு. நட்சத்திரக் குறிகள் போலி சிகிச்சையுடன் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (சி-சதுர சோதனை). n=96.
சுவாரஸ்யமாக, C9 ஐ விட நீளமான ஆல்கைல் பக்கச் சங்கிலிகளைச் சேர்ப்பது தடுப்பு செயல்பாட்டைக் குறைத்தது, இது குமமோட்டோயிக் அமிலம் தொடர்பான சேர்மங்களுக்கு அவற்றின் உயிரியல் செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்த ஒரு குறிப்பிட்ட அளவிலான பக்கச் சங்கிலிகள் தேவை என்பதைக் குறிக்கிறது.
கட்டமைப்பு-செயல்பாட்டு உறவு பகுப்பாய்வு, C9 உர்சோனிக் அமிலமாக மாற்றப்பட்டதையும், உர்சோனிக் அமிலத்தின் (இனி KAND 11 என குறிப்பிடப்படுகிறது) நோனிலாக்ஸி வழித்தோன்றல் மிகவும் பயனுள்ள தாவர வளர்ச்சி தடுப்பானாக இருப்பதையும் காட்டியதால், KAND 11 இன் விரிவான பண்புகளை நாங்கள் மேற்கொண்டோம். அரபிடோப்சிஸை 50 μM KAND 11 உடன் சிகிச்சையளிப்பது முளைப்பதை கிட்டத்தட்ட முற்றிலுமாகத் தடுத்தது, அதே நேரத்தில் KAND 11 இன் குறைந்த செறிவுகள் (40, 30, 20, அல்லது 10 μM) அளவைச் சார்ந்த முறையில் வேர் வளர்ச்சியைத் தடுக்கின்றன (படம் 4a, b). KAND 11 வேர் மெரிஸ்டெமின் நம்பகத்தன்மையை பாதிக்கிறதா என்பதை சோதிக்க, ப்ராப்பிடியம் அயோடைடு (PI) படிந்த வேர் மெரிஸ்டெம்களை ஆய்வு செய்து மெரிஸ்டெம் பகுதி அளவை அளந்தோம். 25 μM KAND-11 கொண்ட ஒரு ஊடகத்தில் வளர்க்கப்படும் நாற்றுகளின் மெரிஸ்டெமின் அளவு 151.1 ± 32.5 μm ஆக இருந்தது, அதே நேரத்தில் DMSO கொண்ட ஒரு கட்டுப்பாட்டு ஊடகத்தில் வளர்க்கப்படும் நாற்றுகளின் மெரிஸ்டெமின் அளவு 264.7 ± 30.8 μm (படம் 4c, d) ஆக இருந்தது, இது KAND-11 செல்லுலார் செயல்பாட்டை மீட்டெடுக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. பரவுகிறது. வேர் மெரிஸ்டெம். இதற்கு இணங்க, KAND 11 சிகிச்சையானது வேர் மெரிஸ்டெமில் உள்ள செல் பிரிவு குறிப்பான CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS சமிக்ஞையின் அளவைக் குறைத்தது (படம் 4e) 17. இந்த முடிவுகள் KAND 11 செல் பெருக்க செயல்பாட்டைக் குறைப்பதன் மூலம் வேர் வளர்ச்சியைத் தடுக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.
உர்பெனோனிக் அமில வழித்தோன்றல்கள் (உர்பெனிலாக்ஸி வழித்தோன்றல்கள்) வளர்ச்சியில் ஏற்படுத்தும் தடுப்பு விளைவு பற்றிய பகுப்பாய்வு. (அ) KAND 11 இன் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட செறிவுகளுடன் MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்படும் 7 நாள் வயதுடைய காட்டு வகை கோல் நாற்றுகள். அளவுகோல் = 1 செ.மீ. (ஆ) வேர் நீளத்தின் அளவு. எழுத்துக்கள் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (டுக்கி HSD சோதனை, ப< 0.05). n>16. தரவு சராசரி ± SD ஆகக் காட்டப்பட்டுள்ளது. (c) 25 μM KAND உடன் அல்லது இல்லாமல் MS தகடுகளில் வளர்க்கப்படும் ப்ராப்பிடியம் அயோடைடு படிந்த காட்டு-வகை கோல் வேர்களின் கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி 11. வெள்ளை அடைப்புக்குறிகள் வேர் மெரிஸ்டெமைக் குறிக்கின்றன. அளவுகோல் பட்டை = 100 µm. (d) வேர் மெரிஸ்டெம் அளவின் அளவு (n = 10 முதல் 11 வரை). புள்ளிவிவர வேறுபாடுகள் t-சோதனையைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டன (p< 0.05). பார்கள் சராசரி மெரிஸ்டெம் அளவைக் குறிக்கின்றன. (e) CDKB2 கட்டமைப்பைக் கொண்ட வேர் மெரிஸ்டெமின் வேறுபட்ட குறுக்கீடு மாறுபாடு (DIC) நுண்ணோக்கி; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND மதிப்பீட்டைப் பயன்படுத்தி அல்லது இல்லாமல் MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்ட 5 நாள் வயதுடைய நாற்றுகளில் 1-GUS கறை படிந்து கறை படிந்துள்ளது.
KAND 11 இன் தாவர நச்சுத்தன்மை, மற்றொரு இருமுனைத் தாவரமான புகையிலை (நிக்கோடியானா டேபாகம்) மற்றும் ஒரு முக்கிய நிலத் தாவர மாதிரி உயிரினமான லிவர்வார்ட் (மார்ச்சாண்டியா பாலிமார்பா) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி மேலும் சோதிக்கப்பட்டது. அரபிடோப்சிஸைப் போலவே, 25 μM KAND 11 கொண்ட நடுத்தரத்தில் வளர்க்கப்பட்ட புகையிலை SR-1 நாற்றுகள் குறுகிய வேர்களை உற்பத்தி செய்தன (படம் 5a). கூடுதலாக, 48 விதைகளில் 40 விதைகள் 200 μM KAND 11 கொண்ட தட்டுகளில் முளைத்தன, அதே நேரத்தில் அனைத்து 48 விதைகளும் போலி சிகிச்சை ஊடகங்களில் முளைத்தன, இது KAND இன் அதிக செறிவுகள் குறிப்பிடத்தக்கவை என்பதைக் குறிக்கிறது (ப< 0.05; chi test -square) புகையிலையின் முளைப்பைத் தடுத்தது. (படம் 5b). கூடுதலாக, லிவர்வோர்ட்டில் பாக்டீரியா வளர்ச்சியைத் தடுத்த KAND 11 இன் செறிவு அரபிடோப்சிஸில் (படம் 5c) பயனுள்ள செறிவுக்கு ஒத்ததாக இருந்தது. இந்த முடிவுகள் KAND 11 பல்வேறு தாவரங்களின் வளர்ச்சியைத் தடுக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது. பின்னர், மனித HeLa செல்கள் மற்றும் Escherichia coli திரிபு DH5α போன்ற பிற உயிரினங்களில் கரடி மோனோமைடு தொடர்பான சேர்மங்களின் சாத்தியமான சைட்டோடாக்ஸிசிட்டியை முறையே உயர் விலங்கு மற்றும் பாக்டீரியா செல்களின் பிரதிநிதிகளாக ஆராய்ந்தோம். தொடர்ச்சியான செல் பெருக்க மதிப்பீடுகளில், கூமமோனமைடு 1, கூமமோனமைடிக் அமிலம் 6 மற்றும் KAND 11 ஆகியவை 100 μM செறிவுகளில் HeLa அல்லது E. coli செல்களின் வளர்ச்சியைப் பாதிக்கவில்லை என்பதைக் கவனித்தோம் (படம் 5d,e).
அரபிடோப்சிஸ் அல்லாத உயிரினங்களில் KAND 11 இன் வளர்ச்சித் தடுப்பு. (அ) இரண்டு வார வயதுடைய காட்டு-வகை SR-1 புகையிலை நாற்றுகள் 25 μM KAND 11 கொண்ட செங்குத்தாக நிலைநிறுத்தப்பட்ட MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்டன. (ஆ) இரண்டு வார வயதுடைய காட்டு-வகை SR-1 புகையிலை நாற்றுகள் 200 μM KAND 11 கொண்ட கிடைமட்டமாக நிலைநிறுத்தப்பட்ட MS தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்டன. (இ) காம்போர்க் B5 தட்டுகளில் KAND 11 இன் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட செறிவுகளுடன் வளர்க்கப்பட்ட இரண்டு வார வயதுடைய காட்டு-வகை Tak-1 லிவர்வார்ட் மொட்டுகள். சிவப்பு அம்புகள் இரண்டு வார அடைகாக்கும் காலத்திற்குள் வளர்வதை நிறுத்திய வித்திகளைக் குறிக்கின்றன. (ஈ) ஹெலா செல்களின் செல் பெருக்க மதிப்பீடு. செல் எண்ணும் கருவி 8 (டோஜிண்டோ) ஐப் பயன்படுத்தி நிலையான நேர இடைவெளியில் சாத்தியமான செல்களின் எண்ணிக்கை அளவிடப்பட்டது. ஒரு கட்டுப்பாடாக, ஹெலா செல்கள் 5 μg/ml ஆக்டினோமைசின் D (Act D) உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன, இது RNA பாலிமரேஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனைத் தடுக்கிறது மற்றும் செல் இறப்பை ஏற்படுத்துகிறது. பகுப்பாய்வுகள் மும்மடங்காக செய்யப்பட்டன. (இ) ஈ. கோலி செல் பெருக்க மதிப்பீடு. OD600 ஐ அளவிடுவதன் மூலம் E. coli வளர்ச்சி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. ஒரு கட்டுப்பாடாக, செல்கள் 50 μg/ml ஆம்பிசிலின் (Amp) உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன, இது பாக்டீரியா செல் சுவர் தொகுப்பைத் தடுக்கிறது. பகுப்பாய்வுகள் மும்மடங்காக செய்யப்பட்டன.
யூராமைடு தொடர்பான சேர்மங்களால் ஏற்படும் சைட்டோடாக்ஸிசிட்டியின் செயல்பாட்டின் பொறிமுறையைப் புரிந்துகொள்ள, மிதமான தடுப்பு விளைவுகளைக் கொண்ட யூர்பெனிக் அமில வழித்தோன்றல்களை நாங்கள் மறு பகுப்பாய்வு செய்தோம். அது படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது. படங்கள் 2b, 6a இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, அதிக செறிவுள்ள (200 μM) உர்மோடோனிக் அமிலம் 6 கொண்ட அகார் தகடுகளில் வளர்க்கப்படும் நாற்றுகள் குறுகிய மற்றும் இடது-வளைந்த வேர்களை (θ = – 23.7 ± 6.1) உற்பத்தி செய்தன, அதே நேரத்தில் கட்டுப்பாட்டு ஊடகத்தில் வளர்க்கப்படும் நாற்றுகளில், நாற்றுகள் கிட்டத்தட்ட நேரான வேர்களை (θ = – 3.8 ± 7.1) உற்பத்தி செய்தன. இந்த சிறப்பியல்பு சாய்ந்த வளர்ச்சி கார்டிகல் மைக்ரோடியூபுல்களின் செயலிழப்பால் விளைகிறது என்று அறியப்படுகிறது. இந்தக் கண்டுபிடிப்புக்கு இணங்க, மைக்ரோடியூபுல்-நிலையை சீர்குலைக்கும் மருந்துகள் டிஸோபிரமைடு மற்றும் ஓரிசலின் ஆகியவை எங்கள் வளர்ச்சி நிலைமைகளின் கீழ் இதேபோன்ற வேர் சாய்வைத் தூண்டின (படங்கள் 2b, 6a). அதே நேரத்தில், நாங்கள் உர்மோடோனிக் அமில வழித்தோன்றல்களை சோதித்தோம், மேலும் அவற்றில் பலவற்றைத் தேர்ந்தெடுத்தோம், அவை சில செறிவுகளில், சாய்ந்த வேர் வளர்ச்சியைத் தூண்டின. 8, 9, மற்றும் 15 ஆகிய சேர்மங்கள் முறையே 75 μM, 50 μM மற்றும் 40 μM இல் வேர் வளர்ச்சியின் திசையை மாற்றின, இந்த சேர்மங்கள் நுண்குழாய்களை திறம்பட நிலைகுலைக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது (படம் 2b, 6a). குறைந்த செறிவில் (15 µM) மிகவும் சக்திவாய்ந்த உர்சோலிக் அமில வழித்தோன்றலான KAND 11 ஐயும் நாங்கள் சோதித்தோம், மேலும் KAND 11 இன் பயன்பாடு வேர் வளர்ச்சியைத் தடுக்கிறது மற்றும் வேர் வளர்ச்சியின் திசை சீரற்றதாக இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம், இருப்பினும் அவை இடதுபுறமாக சாய்ந்தன (படம் C3). மைக்ரோடியூபுல்-நிலைகுறைக்கும் மருந்துகளின் அதிக செறிவுகள் சில நேரங்களில் வேர் சாய்வை ஏற்படுத்துவதற்குப் பதிலாக தாவர வளர்ச்சியைத் தடுக்கின்றன என்பதால், வேர் மேல்தோல் செல்களில் உள்ள கார்டிகல் மைக்ரோடியூபுல்களைக் கவனிப்பதன் மூலம் KAND 11 நுண்குழாய்களைப் பாதிக்கும் சாத்தியத்தை நாங்கள் பின்னர் மதிப்பிட்டோம். 25 μM KAND 11 உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட நாற்று வேர்களின் மேல்தோல் செல்களில் β-டியூபுலின் எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி இம்யூனோஹிஸ்டோ கெமிஸ்ட்ரி, நீட்சி மண்டலத்தில் உள்ள மேல்தோல் செல்களில் கிட்டத்தட்ட அனைத்து கார்டிகல் மைக்ரோடியூபுல்களும் காணாமல் போனதைக் காட்டியது (படம் 6b). இந்த முடிவுகள் குமமோடோனிக் அமிலமும் அதன் வழித்தோன்றல்களும் நுண்குழாய்களில் நேரடியாகவோ அல்லது மறைமுகமாகவோ செயல்பட்டு அவற்றை சீர்குலைக்கின்றன என்பதையும், இந்த சேர்மங்கள் புதிய நுண்குழாய் தடுப்பான்கள் என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
அரபிடோப்சிஸ் தாலியானாவில் உர்சோனிக் அமிலமும் அதன் வழித்தோன்றல்களும் புறணி நுண்குழாய்களை மாற்றுகின்றன. (அ) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட செறிவுகளில் பல்வேறு உர்மோடோனிக் அமில வழித்தோன்றல்களின் முன்னிலையில் வேர் சாய்வு கோணம் அளவிடப்படுகிறது. நுண்குழாய்களைத் தடுக்கும் இரண்டு சேர்மங்களின் விளைவுகளான டிசோபிரமைடு மற்றும் ஓரிசலின் ஆகியவை பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. வேர் வளர்ச்சி கோணத்தை அளவிடப் பயன்படுத்தப்படும் தரநிலையை செருகல் காட்டுகிறது. போலி சிகிச்சையுடன் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை நட்சத்திரக் குறிகள் குறிக்கின்றன (t சோதனை, p< 0.05). n>19. அளவுகோல் பட்டை = 1 செ.மீ. (b) நீள்வட்ட மண்டலத்தில் உள்ள மேல்தோல் செல்களில் உள்ள புறணி நுண்குழாய்கள். 25 μM KAND 11 உடன் அல்லது இல்லாமல் MS தகடுகளில் வளர்க்கப்படும் காட்டு-வகை அரபிடோப்சிஸ் கோல் வேர்களில் உள்ள நுண்குழாய்கள் β-டியூபுலின் முதன்மை ஆன்டிபாடிகள் மற்றும் அலெக்சா ஃப்ளூர்-இணைந்த இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிக்கல் கறை படிதல் மூலம் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. அளவுகோல் பட்டை = 10 µm. (c) வேர் மெரிஸ்டெமில் உள்ள நுண்குழாய்களின் மைட்டோடிக் அமைப்பு. இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிக்கல் கறை படிதல் மூலம் நுண்குழாய்கள் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. புரோஃபேஸ் மண்டலங்கள், சுழல்கள் மற்றும் ஃபிராக்மோபிளாஸ்ட்கள் உள்ளிட்ட மைட்டோடிக் கட்டமைப்புகள் கன்ஃபோகல் படங்களிலிருந்து கணக்கிடப்பட்டன. அம்புகள் மைட்டோடிக் நுண்குழாய் கட்டமைப்புகளைக் குறிக்கின்றன. நட்சத்திரக் குறிகள் போலி சிகிச்சையுடன் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (t சோதனை, p< 0.05). n>9. அளவுகோல் = 50 µm.
உர்சா நுண்குழாய் செயல்பாட்டை சீர்குலைக்கும் திறனைக் கொண்டிருந்தாலும், அதன் செயல்பாட்டு வழிமுறை வழக்கமான நுண்குழாய் டிபாலிமரைசிங் முகவர்களிடமிருந்து வேறுபட்டதாக இருக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது. எடுத்துக்காட்டாக, டிசோபிரமைடு மற்றும் ஓரிசலின் போன்ற நுண்குழாய் டிபாலிமரைசிங் முகவர்களின் அதிக செறிவுகள் எபிடெர்மல் செல்களின் அனிசோட்ரோபிக் விரிவாக்கத்தைத் தூண்டுகின்றன, அதேசமயம் KAND 11 அவ்வாறு செய்யாது. கூடுதலாக, KAND 11 மற்றும் டிசோபிரமைடை இணைந்து பயன்படுத்துவதால் ஒருங்கிணைந்த டிசோபிரமைடு-தூண்டப்பட்ட வேர் வளர்ச்சி பதில் கிடைத்தது, மேலும் KAND 11-தூண்டப்பட்ட வளர்ச்சித் தடுப்பு காணப்பட்டது (படம் S4). KAND 11 க்கு மாற்றப்பட்ட ஹைப்பர்சென்சிட்டிவ் டிசோபிரமைடு 1-1 (phs1-1) இன் பதிலையும் நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். phs1-1 ஒரு நியதி அல்லாத டூபுலின் கைனேஸ் புள்ளி மாற்றத்தைக் கொண்டுள்ளது மற்றும் டிசோபிரமைடுடன் சிகிச்சையளிக்கப்படும்போது குறுகிய வேர்களை உருவாக்குகிறது9,20. KAND 11 கொண்ட அகார் ஊடகத்தில் வளர்க்கப்படும் phs1-1 பிறழ்ந்த நாற்றுகள் டிசோபிரமைட்டில் வளர்க்கப்பட்டதைப் போன்ற குறுகிய வேர்களைக் கொண்டிருந்தன (படம் S5).
கூடுதலாக, KAND 11 உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட நாற்றுகளின் வேர் மெரிஸ்டெமில், புரோஃபேஸ் மண்டலங்கள், சுழல்கள் மற்றும் ஃபிராக்மோபிளாஸ்ட்கள் போன்ற மைட்டோடிக் நுண்குழாய் கட்டமைப்புகளை நாங்கள் கவனித்தோம். CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS க்கான அவதானிப்புகளுக்கு இணங்க, மைட்டோடிக் நுண்குழாய்களின் எண்ணிக்கையில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவு காணப்பட்டது (படம். .6c).
துணை செல்லுலார் தெளிவுத்திறனில் KAND 11 இன் சைட்டோடாக்ஸிசிட்டியை வகைப்படுத்த, புகையிலை BY-2 சஸ்பென்ஷன் செல்களை KAND 11 உடன் சிகிச்சையளித்து அவற்றின் பதிலைக் கவனித்தோம். கார்டிகல் மைக்ரோடியூபூல்களில் KAND 11 இன் விளைவை மதிப்பிடுவதற்காக, ஃப்ளோரசன்ட் மைக்ரோடியூபூல்களை லேபிளிடும் TagRFP-TUA6 ஐ வெளிப்படுத்தும் BY-2 செல்களில் KAND 11 ஐ முதலில் சேர்த்தோம். கார்டிகல் மைக்ரோடியூபூல் அடர்த்தி பட பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி மதிப்பிடப்பட்டது, இது சைட்டோபிளாஸ்மிக் பிக்சல்களில் சைட்டோஸ்கெலிட்டல் பிக்சல்களின் சதவீதத்தை அளவிடுகிறது. 50 μM அல்லது 100 μM KAND 11 உடன் 1 மணி நேரம் சிகிச்சையளித்த பிறகு, அடர்த்தி முறையே 0.94 ± 0.74% அல்லது 0.23 ± 0.28% ஆகக் கணிசமாகக் குறைந்துள்ளது, அதே நேரத்தில் DMSO உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல்களின் அடர்த்தி 1.61 ± 0.34% ஆக இருந்தது (படம் 7a). இந்த முடிவுகள் அரபிடோப்சிஸில் KAND 11 சிகிச்சையானது கார்டிகல் மைக்ரோடியூபுல்களின் டிபாலிமரைசேஷனைத் தூண்டுகிறது என்ற அவதானிப்புடன் ஒத்துப்போகின்றன (படம் 6b). KAND 11 இன் அதே செறிவுடன் சிகிச்சையளித்த பிறகு, GFP-ABD-லேபிளிடப்பட்ட ஆக்டின் இழைகளுடன் BY-2 வரிசையையும் நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம், மேலும் KAND 11 சிகிச்சையானது ஆக்டின் இழைகளை சீர்குலைப்பதைக் கவனித்தோம். 50 μM அல்லது 100 μM KAND 11 உடன் 1 மணிநேரத்திற்கு சிகிச்சையளிப்பது ஆக்டின் இழை அடர்த்தியை முறையே 1.20 ± 0.62% அல்லது 0.61 ± 0.26% ஆகக் கணிசமாகக் குறைத்தது, அதே நேரத்தில் DMSO- சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல்களில் அடர்த்தி 1.69 ± 0.51% ஆக இருந்தது (படம் 2). 7b). இந்த முடிவுகள் ஆக்டின் இழைகளைப் பாதிக்காத புரோபிசாமைடு மற்றும் மைக்ரோடியூபுல்களைப் பாதிக்காத ஆக்டின் டிபாலிமரைசரான லாட்ரன்குலின் B ஆகியவற்றின் விளைவுகளுடன் வேறுபடுகின்றன (SI படம் S6). கூடுதலாக, கூமமோனமைடு 1, கூமமோனமைடு அமிலம் 6, அல்லது KAND 11 ஆகியவற்றுடன் சிகிச்சையளிப்பது HeLa செல்களில் உள்ள நுண்குழாய்களைப் பாதிக்கவில்லை (SI படம் S7). இதனால், KAND 11 இன் செயல்பாட்டு வழிமுறை அறியப்பட்ட சைட்டோஸ்கெலட்டன் சீர்குலைப்பான்களிலிருந்து வேறுபட்டதாக நம்பப்படுகிறது. கூடுதலாக, KAND 11 உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட BY-2 செல்களை நாங்கள் நுண்ணிய முறையில் கவனித்ததில் KAND 11 சிகிச்சையின் போது செல் இறப்பு தொடங்கியதை வெளிப்படுத்தியது மற்றும் Evans நீல நிற கறை படிந்த இறந்த செல்களின் விகிதம் KAND 11 சிகிச்சையின் 30 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு கணிசமாக அதிகரிக்கவில்லை என்பதைக் காட்டியது, அதேசமயம் 50 μM அல்லது 100 μM KAND உடன் 90 நிமிட சிகிச்சைக்குப் பிறகு, இறந்த செல்களின் எண்ணிக்கை முறையே 43.7% அல்லது 80.1% ஆக அதிகரித்தது (படம் 7c). ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்த தரவுகள் KAND 11 என்ற நாவல் உர்சோலிக் அமில வழித்தோன்றல் முன்னர் அறியப்படாத செயல்பாட்டு பொறிமுறையைக் கொண்ட ஒரு தாவர-குறிப்பிட்ட சைட்டோஸ்கெலட்டல் தடுப்பானாகும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
KAND கார்டிகல் நுண்குழாய்கள், ஆக்டின் இழைகள் மற்றும் புகையிலை BY-2 செல்களின் நம்பகத்தன்மையை பாதிக்கிறது. (அ) TagRFP-TUA6 முன்னிலையில் BY-2 செல்களில் கார்டிகல் நுண்குழாய்களின் காட்சிப்படுத்தல். KAND 11 (50 μM அல்லது 100 μM) அல்லது DMSO உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட BY-2 செல்கள் கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. கார்டிகல் நுண்குழாய் அடர்த்தி 25 சுயாதீன செல்களின் மைக்ரோகிராஃப்களிலிருந்து கணக்கிடப்பட்டது. கடிதங்கள் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (Tukey HSD சோதனை, ப< 0.05). அளவுகோல் = 10 µm. (b) GFP-ABD2 முன்னிலையில் காட்சிப்படுத்தப்பட்ட BY-2 செல்களில் உள்ள கார்டிகல் ஆக்டின் இழைகள். KAND 11 (50 μM அல்லது 100 μM) அல்லது DMSO உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட BY-2 செல்கள் கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோபி மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. கார்டிகல் ஆக்டின் இழைகளின் அடர்த்தி 25 சுயாதீன செல்களின் மைக்ரோகிராஃப்களிலிருந்து கணக்கிடப்பட்டது. எழுத்துக்கள் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளைக் குறிக்கின்றன (Tukey HSD சோதனை, p< 0.05). அளவுகோல் = 10 µm. (c) எவன்ஸ் நீல நிறக் கறை படிந்த BY-2 செல்களைக் கவனித்தல். KAND 11 (50 μM அல்லது 100 μM) அல்லது DMSO உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட BY-2 செல்கள் பிரகாசமான புல நுண்ணோக்கி மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. n=3. அளவுகோல் = 100 µm.
புதிய இயற்கைப் பொருட்களின் கண்டுபிடிப்பு மற்றும் பயன்பாடு மருத்துவம் மற்றும் விவசாயம் உட்பட மனித வாழ்க்கையின் பல்வேறு அம்சங்களில் குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றங்களுக்கு வழிவகுத்துள்ளது. இயற்கை வளங்களிலிருந்து பயனுள்ள சேர்மங்களைப் பெறுவதற்கு வரலாற்று ஆராய்ச்சி மேற்கொள்ளப்பட்டுள்ளது. குறிப்பாக, ஆக்டினோமைசீட்கள், அவெர்மெக்டின், ஐவர்மெக்டின் மற்றும் ப்ளியோமைசின் ஆகியவற்றின் ஈய கலவை மற்றும் அதன் வழித்தோன்றல்கள் போன்ற பல்வேறு இரண்டாம் நிலை வளர்சிதை மாற்றங்களை உற்பத்தி செய்யும் திறன் காரணமாக நூற்புழுக்களுக்கு ஒட்டுண்ணி எதிர்ப்பு நுண்ணுயிர் எதிர்ப்பிகளாக பயனுள்ளதாக இருக்கும் என்று அறியப்படுகிறது. இது புற்றுநோய் எதிர்ப்பு முகவராக மருத்துவ ரீதியாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது21,22. அதேபோல், ஆக்டினோமைசீட்களிலிருந்து பல்வேறு களைக்கொல்லி சேர்மங்கள் கண்டுபிடிக்கப்பட்டுள்ளன, அவற்றில் சில ஏற்கனவே வணிக ரீதியாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன1,23. எனவே, விரும்பிய உயிரியல் செயல்பாடுகளுடன் இயற்கை தயாரிப்புகளை தனிமைப்படுத்த ஆக்டினோமைசீட் வளர்சிதை மாற்றங்களின் பகுப்பாய்வு ஒரு பயனுள்ள உத்தியாகக் கருதப்படுகிறது. இந்த ஆய்வில், எஸ். வெர்ரென்சிஸிலிருந்து கூமமோனமைடு என்ற புதிய சேர்மத்தைக் கண்டுபிடித்து அதை வெற்றிகரமாக ஒருங்கிணைக்கிறோம். உர்சோனிக் அமிலம் என்பது உர்பெனமைடு மற்றும் அதன் வழித்தோன்றல்களின் செயற்கை இடைநிலை ஆகும். இது சிறப்பியல்பு வேர் சுருட்டை ஏற்படுத்தும், மிதமான முதல் வலுவான களைக்கொல்லி செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்தும் மற்றும் நேரடியாகவோ அல்லது மறைமுகமாகவோ தாவர நுண்குழாய்களை சேதப்படுத்தும். இருப்பினும், உர்மோடோனிக் அமிலத்தின் செயல்பாட்டின் வழிமுறை தற்போதுள்ள நுண்குழாய் தடுப்பான்களிலிருந்து வேறுபடலாம், ஏனெனில் KAND 11 ஆக்டின் இழைகளையும் சீர்குலைத்து உயிரணு இறப்பை ஏற்படுத்துகிறது, இது உர்மோடோனிக் அமிலமும் அதன் வழித்தோன்றல்களும் பரந்த அளவிலான சைட்டோஸ்கெலிட்டல் கட்டமைப்புகளை பாதிக்கும் ஒரு ஒழுங்குமுறை பொறிமுறையைக் குறிக்கிறது.
உர்பெனோனிக் அமிலத்தின் மேலும் விரிவான பண்புக்கூறு, உர்பெனோனிக் அமிலத்தின் செயல்பாட்டின் பொறிமுறையை நன்கு புரிந்துகொள்ள உதவும். குறிப்பாக, உர்சோனிக் அமிலம் குறைக்கப்பட்ட நுண்குழாய்களுடன் பிணைக்கும் திறனை மதிப்பிடுவதே அடுத்த இலக்காகும், இது உர்சோனிக் அமிலமும் அதன் வழித்தோன்றல்களும் நுண்குழாய்களில் நேரடியாகச் செயல்பட்டு அவற்றை டிபாலிமரைஸ் செய்கிறதா, அல்லது அவற்றின் செயல் நுண்குழாய் ஸ்திரமின்மைக்கு வழிவகுக்குமா என்பதை தீர்மானிக்கிறது. கூடுதலாக, நுண்குழாய்கள் நேரடி இலக்காக இல்லாத நிலையில், தாவர செல்களில் உர்சோனிக் அமிலத்தின் செயல்பாட்டு தளம் மற்றும் மூலக்கூறு இலக்குகளை அடையாளம் காண்பது தொடர்புடைய சேர்மங்களின் பண்புகள் மற்றும் களைக்கொல்லி செயல்பாட்டை மேம்படுத்துவதற்கான சாத்தியமான வழிகளை மேலும் புரிந்துகொள்ள உதவும். எங்கள் உயிரியல் செயல்பாடு மதிப்பீடு அரபிடோப்சிஸ் தாலியானா, புகையிலை மற்றும் லிவர்வார்ட் போன்ற தாவரங்களின் வளர்ச்சியில் உர்சோனிக் அமிலத்தின் தனித்துவமான சைட்டோடாக்ஸிக் திறனை வெளிப்படுத்தியது, அதே நேரத்தில் ஈ. கோலி அல்லது ஹெலா செல்கள் எதுவும் பாதிக்கப்படவில்லை. திறந்த விவசாய வயல்களில் பயன்படுத்த களைக்கொல்லிகளாக உருவாக்கப்பட்டால், விலங்கு செல்களுக்கு சிறிய அல்லது நச்சுத்தன்மை இல்லாதது உர்சோனிக் அமில வழித்தோன்றல்களின் ஒரு நன்மையாகும். உண்மையில், யூகாரியோட்டுகளில் நுண்குழாய்கள் பொதுவான கட்டமைப்புகளாக இருப்பதால், தாவரங்களில் அவற்றின் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட தடுப்பு களைக்கொல்லிகளுக்கு ஒரு முக்கிய தேவையாகும். எடுத்துக்காட்டாக, டியூபுலினுடன் நேரடியாக பிணைக்கப்பட்டு பாலிமரைசேஷனைத் தடுக்கும் நுண்குழாய் டிபாலிமரைசிங் முகவரான புரோபிசாமைடு, விலங்கு செல்களுக்கு அதன் குறைந்த நச்சுத்தன்மை காரணமாக களைக்கொல்லியாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது24. டிசோபிரமைடுக்கு மாறாக, தொடர்புடைய பென்சாமைடுகள் வெவ்வேறு இலக்கு விவரக்குறிப்புகளைக் கொண்டுள்ளன. தாவர நுண்குழாய்களுக்கு கூடுதலாக, RH-4032 அல்லது பென்சாக்சமைடு முறையே விலங்கு செல்கள் அல்லது ஓமைசீட்களின் நுண்குழாய்களையும் தடுக்கிறது, மேலும் ஜாலிலமைடு அதன் குறைந்த பைட்டோடாக்சிசிட்டி காரணமாக பூஞ்சைக் கொல்லியாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது25,26,27. புதிதாகக் கண்டுபிடிக்கப்பட்ட கரடி மற்றும் அதன் வழித்தோன்றல்கள் தாவரங்களுக்கு எதிராக தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட சைட்டோடாக்சிசிட்டியை வெளிப்படுத்துகின்றன, ஆனால் மேலும் மாற்றங்கள் அவற்றின் இலக்கு தனித்தன்மையை மாற்றக்கூடும், இது நோய்க்கிருமி பூஞ்சை அல்லது ஓமைசீட்களைக் கட்டுப்படுத்த கூடுதல் வழித்தோன்றல்களை வழங்கும் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது.
உர்பெனோனிக் அமிலம் மற்றும் அதன் வழித்தோன்றல்களின் தனித்துவமான பண்புகள், களைக்கொல்லிகளாகவும் ஆராய்ச்சி கருவிகளாகவும் பயன்படுத்துவதற்கு பயனுள்ளதாக இருக்கும். தாவர செல் வடிவத்தைக் கட்டுப்படுத்துவதில் சைட்டோஸ்கெலட்டனின் முக்கியத்துவம் பரவலாக அங்கீகரிக்கப்பட்டுள்ளது. முந்தைய ஆய்வுகள், தாவரங்கள் நுண்குழாய் இயக்கவியலைக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம் புறணி நுண்குழாய் அமைப்பின் சிக்கலான வழிமுறைகளை உருவாக்கியுள்ளன என்பதைக் காட்டுகின்றன, இதனால் உருவவியல் உருவாக்கத்தை முறையாகக் கட்டுப்படுத்த முடியும். நுண்குழாய் செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துவதற்குப் பொறுப்பான ஏராளமான மூலக்கூறுகள் அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன, மேலும் தொடர்புடைய ஆராய்ச்சி இன்னும் நடந்து வருகிறது3,4,28. தாவர செல்களில் நுண்குழாய் இயக்கவியல் பற்றிய நமது தற்போதைய புரிதல் புறணி நுண்குழாய் அமைப்பின் வழிமுறைகளை முழுமையாக விளக்கவில்லை. எடுத்துக்காட்டாக, டிஸோபிரமைடு மற்றும் ஓரிசலின் இரண்டும் நுண்குழாய்களை டிபாலிமரைஸ் செய்ய முடியும் என்றாலும், டிஸோபிரமைடு கடுமையான வேர் சிதைவை ஏற்படுத்துகிறது, அதே நேரத்தில் ஓரிசலின் ஒப்பீட்டளவில் லேசான விளைவைக் கொண்டுள்ளது. மேலும், நுண்குழாய்களை நிலைப்படுத்தும் டியூபுலினில் உள்ள பிறழ்வுகள் வேர்களில் டெக்ஸ்ட்ரோரோடேஷனையும் ஏற்படுத்துகின்றன, அதேசமயம் நுண்குழாய் இயக்கவியலை நிலைப்படுத்தும் பாக்லிடாக்சல் அவ்வாறு செய்யாது. எனவே, உர்சோலிக் அமிலத்தின் மூலக்கூறு இலக்குகளைப் படிப்பதும் அடையாளம் காண்பதும் தாவரப் புறணி நுண்குழாய்களின் ஒழுங்குமுறை குறித்த புதிய நுண்ணறிவுகளை வழங்க வேண்டும். அதேபோல், சிதைந்த வளர்ச்சியை ஊக்குவிப்பதில் பயனுள்ளதாக இருக்கும் டிஸோபிரமைடு போன்ற இரசாயனங்கள் மற்றும் ஓரிசலின் அல்லது குமாமோட்டோரிக் அமிலம் போன்ற குறைவான செயல்திறன் கொண்ட இரசாயனங்களின் எதிர்கால ஒப்பீடுகள், சிதைந்த வளர்ச்சி எவ்வாறு நிகழ்கிறது என்பதற்கான தடயங்களை வழங்கும்.
மறுபுறம், உர்சோனிக் அமிலத்தின் சைட்டோடாக்ஸிசிட்டியை விளக்க பாதுகாப்பு தொடர்பான சைட்டோஸ்கெலிட்டல் மறுசீரமைப்புகள் மற்றொரு சாத்தியமாகும். ஒரு நோய்க்கிருமியின் தொற்று அல்லது தாவர செல்களில் ஒரு எலிசிட்டரை அறிமுகப்படுத்துவது சில நேரங்களில் சைட்டோஸ்கெலட்டனின் அழிவையும் அதைத் தொடர்ந்து செல் இறப்பையும் ஏற்படுத்துகிறது29. எடுத்துக்காட்டாக, ஓமைசீட்-பெறப்பட்ட கிரிப்டோக்சாந்தின் புகையிலை செல் இறப்புக்கு முன் நுண்குழாய்கள் மற்றும் ஆக்டின் இழைகளை சீர்குலைப்பதாக அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது, இது KAND சிகிச்சையில் நிகழும் 30,31 ஐப் போன்றது. உர்சோனிக் அமிலத்தால் தூண்டப்படும் பாதுகாப்பு பதில்களுக்கும் செல்லுலார் பதில்களுக்கும் இடையிலான ஒற்றுமைகள், அவை பொதுவான செல்லுலார் செயல்முறைகளைத் தூண்டுகின்றன என்று கருதுகோளுக்கு வழிவகுத்தன, இருப்பினும் கிரிப்டோக்சாந்தினை விட உர்சோனிக் அமிலத்தின் வேகமான மற்றும் வலுவான விளைவு தெளிவாகத் தெரிகிறது. இருப்பினும், ஆக்டின் இழைகளின் சீர்குலைவு தன்னிச்சையான செல் இறப்பை ஊக்குவிக்கிறது என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன, இது எப்போதும் மைக்ரோடியூபுல் சீர்குலைவுடன் இருக்காது29. கூடுதலாக, உர்சோனிக் அமில வழித்தோன்றல்கள் செய்வது போல, நோய்க்கிருமி அல்லது எலிசிட்டர் சிதைந்த வேர் வளர்ச்சியை ஏற்படுத்துகிறதா என்பதைப் பார்க்க வேண்டும். எனவே, பாதுகாப்பு பதில்களையும் சைட்டோஸ்கெலட்டனையும் இணைக்கும் மூலக்கூறு அறிவு கவனிக்கப்பட வேண்டிய ஒரு கவர்ச்சிகரமான பிரச்சனையாகும். உர்சோனிக் அமிலத்துடன் தொடர்புடைய குறைந்த மூலக்கூறு எடை சேர்மங்கள் மற்றும் மாறுபட்ட ஆற்றல்களைக் கொண்ட பல்வேறு வழித்தோன்றல்களின் இருப்பைப் பயன்படுத்தி, அவை அறியப்படாத செல்லுலார் வழிமுறைகளை குறிவைக்கும் வாய்ப்புகளை வழங்கக்கூடும்.
ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், நுண்குழாய் இயக்கவியலை மாற்றியமைக்கும் புதிய சேர்மங்களின் கண்டுபிடிப்பு மற்றும் பயன்பாடு, தாவர செல் வடிவ நிர்ணயத்தின் அடிப்படையிலான சிக்கலான மூலக்கூறு வழிமுறைகளை நிவர்த்தி செய்வதற்கான சக்திவாய்ந்த முறைகளை வழங்கும். இந்த சூழலில், நுண்குழாய்கள் மற்றும் ஆக்டின் இழைகளைப் பாதித்து உயிரணு இறப்பைத் தூண்டும் சமீபத்தில் உருவாக்கப்பட்ட உர்மோடோனிக் அமிலம், நுண்குழாய் கட்டுப்பாடு மற்றும் இந்த பிற வழிமுறைகளுக்கு இடையிலான தொடர்பைப் புரிந்துகொள்ள ஒரு வாய்ப்பை வழங்கக்கூடும். எனவே, உர்பெனோனிக் அமிலத்தைப் பயன்படுத்தி வேதியியல் மற்றும் உயிரியல் பகுப்பாய்வு செய்வது, தாவர சைட்டோஸ்கெலட்டனைக் கட்டுப்படுத்தும் மூலக்கூறு ஒழுங்குமுறை வழிமுறைகளைப் புரிந்துகொள்ள உதவும்.
2% (w/v) கேலக்டோஸ், 2% (w/v) எசென்ஸ் பேஸ்ட், 1% (w/v) பாக்டோ கலவை கொண்ட 110 மிலி விதை ஊடகம் கொண்ட 500 மிலி பேஃபிள் செய்யப்பட்ட எர்லென்மேயர் பிளாஸ்கில் S. வெர்ரென்சிஸ் MK493-CF1 ஐ ஊசி மூலம் செலுத்தவும். -சோய்டன் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், இன்க்.), 0.5% (w/v) சோள சாறு (KOGOSTCH Co., Ltd., ஜப்பான்), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 மற்றும் 0.2% CaCO3 ஆகியவற்றை டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட தண்ணீரில் கலக்கவும். (கருத்தடைக்கு முன் pH 7.4). விதை வளர்ப்பு 27°C வெப்பநிலையில் ஒரு சுழலும் ஷேக்கரில் (180 rpm) 2 நாட்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டது. திட நிலை நொதித்தல் மூலம் உற்பத்தி சாகுபடி. விதை வளர்ப்பு (7 மில்லி) 15 கிராம் அழுத்தப்பட்ட பார்லி (MUSO Co., Ltd., ஜப்பான்) மற்றும் 25 கிராம் அயனியாக்கம் நீக்கப்பட்ட நீர் (கருத்தடைக்கு முன் pH சரிசெய்யப்படவில்லை) ஆகியவற்றைக் கொண்ட 40 கிராம் உற்பத்தி ஊடகம் கொண்ட 500 மில்லி K-1 பிளாஸ்கில் மாற்றப்பட்டது. 14 நாட்களுக்கு இருட்டில் 30°C வெப்பநிலையில் நொதித்தல் மேற்கொள்ளப்பட்டது. நொதித்தல் பொருள் 40 மில்லி/பாட்டில் EtOH உடன் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது (1500 கிராம், 4°C, 10 நிமிடம்). 10% MeOH/EtOAc கலவையுடன் வளர்ப்பு சூப்பர்நேட்டண்ட் (60 மில்லி) பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. குறைக்கப்பட்ட அழுத்தத்தின் கீழ் கரிம அடுக்கு ஆவியாக்கப்பட்டு ஒரு எச்சத்தை (59.5 மி.கி) பெற்றது, இது ஒரு தலைகீழ் கட்ட நெடுவரிசையில் சாய்வு நீக்கம் (0–10 நிமிடங்கள்: 90%) மூலம் HPLC க்கு உட்படுத்தப்பட்டது (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 மிமீ × நீளம் 250 மிமீ) H2O/CH3CN, 10–35 நிமிடங்கள்: 90% H2O/CH3CN முதல் 70% H2O/CH3CN (சாய்வு), 35–45 நிமிடங்கள்: 90% H2O/EtOH, 45–155 நிமிடங்கள்: 90% H2O/EtOH முதல் 100% EtOH (சாய்வு (சாய்வு), 155–200 நிமிடம்: 100% EtOH) 1.5 மிலி/நிமிடம் ஓட்ட விகிதத்தில், கூமமோனமைடு (1, 36.0 மி.கி) ஒரு வெள்ளை உருவமற்ற பொடியாக தனிமைப்படுத்தப்பட்டது.
குமாமோட்டோஅமைடு(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ கணக்கிடப்பட்ட மதிப்பு: 141.0659, அளவிடப்பட்ட மதிப்பு: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 செ.மீ–1.
கொலம்பியா விதைகள் (Col-0) அரபிடோப்சிஸ் உயிரியல் வள மையத்திலிருந்து (ABRC) ஆராய்ச்சி பயன்பாட்டிற்கான அனுமதியுடன் பெறப்பட்டன. கோல்-0 விதைகள் எங்கள் ஆய்வக நிலைமைகளின் கீழ் இனப்பெருக்கம் செய்யப்பட்டு பராமரிக்கப்பட்டு காட்டு வகை அரபிடோப்சிஸ் தாவரங்களாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. அரபிடோப்சிஸ் விதைகள் மேற்பரப்பு கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்டு அரை வலிமை கொண்ட முராஷிகே மற்றும் ஸ்கூக் ஊடகத்தில் 2% சுக்ரோஸ் (ஃபுஜிஃபில்ம் வகோ ப்யூர் கெமிக்கல்), 0.05% (w/v) 2-(4-மார்போலினோ) எத்தனெசல்போனிக் அமிலம் (MES) (ஃபுஜிஃபில்ம் வகோ ப்யூர் கெமிக்கல்) மற்றும் 1.5% அகார் (ஃபுஜிஃபில்ம் வகோ ப்யூர் கெமிக்கல்), pH 5.7, 23 °C மற்றும் நிலையான ஒளியில் வளர்க்கப்பட்டன. phs1-1 விகாரியின் விதைகள் T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ஆல் வழங்கப்பட்டன.
SR-1 வகை விதைகளை டி. ஹாஷிமோட்டோ (நாரா அறிவியல் மற்றும் தொழில்நுட்ப நிறுவனம்) வழங்கினார், மேலும் அவை காட்டு வகை புகையிலை தாவரங்களாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. புகையிலை விதைகள் மேற்பரப்பு கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்டு முளைப்பதை ஊக்குவிக்க மூன்று இரவுகள் மலட்டு நீரில் ஊறவைக்கப்பட்டன, பின்னர் 2% சுக்ரோஸ், 0.05% (w/v) MES, மற்றும் 0.8% கெல்லன் கம் (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. மற்றும் Skoog medium) ஆகியவற்றைக் கொண்ட அரை-வலிமை கரைசலில் pH 5.7 உடன் வைக்கப்பட்டு, நிலையான ஒளியின் கீழ் 23°C வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்பட்டன.
ஸ்ட்ரெய்ன் டாக்-1, டி. கோச்சி (கியோட்டோ பல்கலைக்கழகம்) என்பவரால் வழங்கப்பட்டது, மேலும் இது லிவர்வார்ட் ஆய்வுக்கான நிலையான பரிசோதனை அலகாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்ட வளர்ப்பு தாவரங்களிலிருந்து ஜெம்மா பெறப்பட்டது, பின்னர் 1% சுக்ரோஸ் மற்றும் 0.3% கெல்லன் கம் கொண்ட காம்போர்க் பி5 ஊடகத்தில் (ஃபுஜிஃபில்ம் வாகோ ப்யூர் கெமிக்கல்) பூசப்பட்டு, தொடர்ச்சியான ஒளியின் கீழ் 23°C வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்பட்டது.
புகையிலை BY-2 செல்கள் (நிக்கோடியானா டபாகம் எல். சி.வி. பிரைட் யெல்லோ 2) எஸ். ஹசேசாவா (டோக்கியோ பல்கலைக்கழகம்) அவர்களால் வழங்கப்பட்டன. BY-2 செல்கள் மாற்றியமைக்கப்பட்ட லின்ஸ்மியர் மற்றும் ஸ்கூக் ஊடகத்தில் 95 மடங்கு நீர்த்தப்பட்டு, வாரந்தோறும் 2,4-டைக்ளோரோஃபெனாக்சிஅசெடிக் அமிலம் 32 உடன் கூடுதலாக வழங்கப்பட்டன. செல் சஸ்பென்ஷன் இருட்டில் 27°C இல் 130 rpm இல் ஒரு ரோட்டரி ஷேக்கரில் கலக்கப்பட்டது. புதிய ஊடகத்தின் 10 மடங்கு அளவைக் கொண்டு செல்களைக் கழுவி, அதே ஊடகத்தில் மீண்டும் இணைக்கவும். காலிஃபிளவர் மொசைக் வைரஸ் 35S ஊக்குவிப்பாளரின் கீழ் மைக்ரோடியூபுல் மார்க்கர் TagRFP-TUA6 அல்லது ஆக்டின் இழை மார்க்கர் GFP-ABD2 ஐ நிலையான முறையில் வெளிப்படுத்தும் BY-2 டிரான்ஸ்ஜெனிக் செல் கோடுகள் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி உருவாக்கப்பட்டன33,34,35. இந்த செல் கோடுகளை அசல் BY-2 செல் கோட்டிற்குப் பயன்படுத்தப்படும் நடைமுறைகளைப் பயன்படுத்தி பராமரிக்கலாம் மற்றும் ஒத்திசைக்கலாம்.
5% CO2 உடன் 37°C இன்குபேட்டரில் 10% கரு போவின் சீரம், 1.2 U/ml பென்சிலின் மற்றும் 1.2 μg/ml ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் ஆகியவற்றுடன் கூடுதலாக டல்பெக்கோவின் மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஈகிள்ஸ் மீடியம் (DMEM) (லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) இல் HeLa செல்கள் வளர்க்கப்பட்டன.
இந்த கையெழுத்துப் பிரதியில் விவரிக்கப்பட்டுள்ள அனைத்து சோதனைகளும் ஜப்பானிய உயிரியல் பாதுகாப்பு விதிமுறைகள் மற்றும் வழிகாட்டுதல்களின்படி செய்யப்பட்டன.
சேர்மங்கள் டைமெதில் சல்பாக்சைடில் (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) பங்கு கரைசல்களாக கரைக்கப்பட்டு, அரபிடோப்சிஸுக்கு MS ஊடகத்திலும், லிவர்வோர்ட்டுக்கு புகையிலை அல்லது காம்போர்க் B5 ஊடகத்திலும் நீர்த்தப்பட்டன. வேர் வளர்ச்சி தடுப்பு மதிப்பீட்டிற்கு, ஒரு தட்டுக்கு 10 க்கும் மேற்பட்ட விதைகள் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட சேர்மங்கள் அல்லது DMSO கொண்ட அகர் ஊடகத்தில் விதைக்கப்பட்டன. விதைகள் 7 நாட்களுக்கு ஒரு வளர்ச்சி அறையில் அடைகாக்கப்பட்டன. நாற்றுகள் புகைப்படம் எடுக்கப்பட்டு வேர்களின் நீளம் அளவிடப்பட்டது. அரபிடோப்சிஸ் முளைப்பு மதிப்பீட்டிற்கு, ஒரு தட்டுக்கு 48 விதைகள் 200 μM கலவை அல்லது DMSO கொண்ட அகர் ஊடகத்தில் விதைக்கப்பட்டன. அரபிடோப்சிஸ் விதைகள் ஒரு வளர்ச்சி அறையில் வளர்க்கப்பட்டன மற்றும் முளைத்த நாற்றுகளின் எண்ணிக்கை முளைத்த 7 நாட்களுக்குப் பிறகு (dag) கணக்கிடப்பட்டது. புகையிலை முளைப்பு மதிப்பீட்டிற்கு, ஒரு தட்டுக்கு 24 விதைகள் 200 μM KAND அல்லது DMSO கொண்ட அகர் ஊடகத்தில் விதைக்கப்பட்டன. புகையிலை விதைகள் ஒரு வளர்ச்சி அறையில் வளர்க்கப்பட்டன, மேலும் முளைத்த நாற்றுகளின் எண்ணிக்கை 14 நாட்களுக்குப் பிறகு கணக்கிடப்பட்டது. லிவர்வார்ட் வளர்ச்சி தடுப்பு மதிப்பீட்டிற்காக, ஒவ்வொரு தட்டிலிருந்தும் 9 கருக்கள் KAND அல்லது DMSO இன் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட செறிவுகளைக் கொண்ட அகார் ஊடகத்தில் பூசப்பட்டு 14 நாட்களுக்கு ஒரு வளர்ச்சி அறையில் அடைகாக்கப்பட்டன.
வேர் மெரிஸ்டெம் அமைப்பைக் காட்சிப்படுத்த 5 மி.கி/மி.லி ப்ராப்பிடியம் அயோடைடு (PI) படிந்த நாற்றுகளைப் பயன்படுத்தவும். TCS SPE கன்போகல் லேசர் ஸ்கேனிங் நுண்ணோக்கி (லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ்) ஐப் பயன்படுத்தி ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கி மூலம் PI சமிக்ஞைகள் காணப்பட்டன.
மலாமி மற்றும் பென்ஃபி36 விவரித்த நெறிமுறையின்படி வேர்களின் ஹிஸ்டோகெமிக்கல் சாயம் பூசப்பட்டது. நாற்றுகள் இரவு முழுவதும் 90% அசிட்டோனில் நிலைநிறுத்தப்பட்டு, GUS பஃபரில் 0.5 மி.கி/மி.லி 5-புரோமோ-4-குளோரோ-3-இண்டோலைல்-β-டி-குளுகுரோனிக் அமிலத்துடன் சாயம் பூசப்பட்டு, நீரேற்றப்பட்ட குளோரால்டிஹைட் கரைசலில் 1 மணி நேரம் வைக்கப்பட்டன. (8 கிராம் குளோரல் ஹைட்ரேட், 2 மில்லி தண்ணீர் மற்றும் 1 மில்லி கிளிசரால்) மற்றும் ஆக்சியோ இமேஜர் M1 நுண்ணோக்கி (கார்ல் ஜெய்ஸ்) ஐப் பயன்படுத்தி வேறுபட்ட குறுக்கீடு மாறுபாடு நுண்ணோக்கி மூலம் கவனிக்கப்பட்டது.
செங்குத்தாக வைக்கப்பட்ட தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்ட 7 நாள் வயதுடைய நாற்றுகளில் வேர் கோணங்கள் அளவிடப்பட்டன. படி 6 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி ஈர்ப்பு திசையனின் திசையிலிருந்து வேரின் கோணத்தை அளவிடவும்.
நெறிமுறை 37 இல் சிறிய மாற்றங்களுடன், விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி புறணி நுண்குழாய்களின் ஏற்பாடு காணப்பட்டது. ஆன்டி-β-டியூபுலின் ஆன்டிபாடி (KMX-1, மெர்க் மில்லிபோர்: MAB3408) மற்றும் அலெக்சா ஃப்ளூர் 488-இணைந்த மவுஸ் எதிர்ப்பு IgG (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்: A32723) ஆகியவை முறையே 1:1000 மற்றும் 1:100 நீர்த்தங்களில் முதன்மை மற்றும் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன. TCS SPE கன்ஃபோகல் லேசர் ஸ்கேனிங் மைக்ரோஸ்கோப்பை (லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ்) பயன்படுத்தி ஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள் பெறப்பட்டன. Z-ஸ்டேக் படங்களைப் பெற்று, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி அதிகபட்ச தீவிரத் திட்டங்களை உருவாக்குங்கள்.
உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி செல் எண்ணும் கருவி 8 (டோஜிண்டோ) ஐப் பயன்படுத்தி ஹெலா செல் பெருக்க மதிப்பீடு செய்யப்பட்டது.
600 nm (OD600) இல் ஒரு ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி வளர்ப்பில் செல் அடர்த்தியை அளவிடுவதன் மூலம் E. coli DH5α இன் வளர்ச்சி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
டிரான்ஸ்ஜெனிக் BY-2 செல்களில் சைட்டோஸ்கெலிட்டல் அமைப்பு, CSU-X1 கன்ஃபோகல் ஸ்கேனிங் சாதனம் (யோகோகாவா) மற்றும் ஒரு sCMOS கேமரா (ஸைலா, ஆண்டோர் டெக்னாலஜி) பொருத்தப்பட்ட ஒரு ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்திக் காணப்பட்டது. சைட்டோஸ்கெலிட்டல் அடர்த்தி பட பகுப்பாய்வு மூலம் மதிப்பிடப்பட்டது, இது ImageJ மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி கன்ஃபோகல் படங்களில் சைட்டோபிளாஸ்மிக் பிக்சல்களில் சைட்டோஸ்கெலிட்டல் பிக்சல்களின் சதவீதத்தை அளவிடுகிறது38,39.
BY-2 செல்களில் செல் இறப்பைக் கண்டறிய, செல் இடைநீக்கத்தின் ஒரு பகுதி அறை வெப்பநிலையில் 0.05% எவன்ஸ் நீலத்துடன் 10 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டது. இறந்த செல்களின் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட எவன்ஸ் நீல நிறக் கறை, அப்படியே பிளாஸ்மா சவ்வு மூலம் சாத்தியமான செல்களிலிருந்து சாயத்தை வெளியேற்றுவதைப் பொறுத்தது. பிரகாசமான-புல நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி (BX53, ஒலிம்பஸ்) கறை படிந்த செல்கள் காணப்பட்டன.
37°C மற்றும் 5% CO2 வெப்பநிலையில் ஈரப்பதமான இன்குபேட்டரில் 10% FBS உடன் கூடுதலாக DMEM இல் HeLa செல்கள் வளர்க்கப்பட்டன. செல்கள் 37°C வெப்பநிலையில் 6 மணிநேரத்திற்கு 100 μM KAND 11, குமாமோனாமிக் அமிலம் 6, குமாமோனமைடு 1, 100 ng/ml கோல்செமிட் (Gibco), அல்லது 100 ng/ml நோகோட்மேஸ் (சிக்மா) ஆகியவற்றால் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. செல்கள் 10 நிமிடங்களுக்கு MetOH உடன் சரி செய்யப்பட்டன, பின்னர் அறை வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு அசிடேட்டுடன் சரி செய்யப்பட்டன. நிலையான செல்கள் 0.5% BSA/PBS இல் 2 மணி நேரம் நீர்த்த β-டியூபுலின் முதன்மை ஆன்டிபாடி (1D4A4, Proteintech: 66240-1) உடன் அடைகாக்கப்பட்டன, TBST உடன் 3 முறை கழுவப்பட்டன, பின்னர் அலெக்சா ஃப்ளூர் ஆடு ஆன்டிபாடியுடன் அடைகாக்கப்பட்டன. 488 1 மணிநேரம். – மவுஸ் IgG (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்: A11001) மற்றும் 15 ng/ml 4′,6-டயமிடினோ-2-ஃபீனைலிண்டோல் (DAPI) 0.5% BSA/PBS இல் நீர்த்தப்பட்டது. TBST உடன் மூன்று முறை கழுவிய பிறகு, நிகான் எக்லிப்ஸ் Ti-E தலைகீழ் நுண்ணோக்கியில் கறை படிந்த செல்கள் காணப்பட்டன. மெட்டாமார்ஃப் மென்பொருளை (மூலக்கூறு சாதனங்கள்) பயன்படுத்தி குளிரூட்டப்பட்ட ஹமாமட்சு ORCA-R2 CCD கேமரா மூலம் படங்கள் பிடிக்கப்பட்டன.